Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Immuno microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen te bestuderen op het subcellulaire niveau. Antilichamen gekoppeld aan elektron-dichte markers zoals colloïdaal goud kan onthullen de lokalisatie en distributie van specifieke antigenen in verschillende weefsels ^1. De twee meest gebruikte technieken zijn pre-embedding en na inbedding technieken. In pre-embedding immunogoud-elektronenmicroscopie (EM) techniek, moet het weefsel worden gepermeabiliseerd om antilichaam kan binnendringen voordat het wordt ingebed. Deze technieken zijn ideaal voor het bewaren van organen, maar slechte penetratie van het antilichaam (vaak alleen de eerste paar micrometer) een aanzienlijk nadeel ^2. De post-embedding labeling methoden kunnen voorkomen dat dit probleem, omdat de etikettering vindt plaats op delen van vaste weefsels waar antigenen zijn gemakkelijker toegankelijk. Over de jaren zijn een aantal wijzigingen verbeterde de post-embedding methoden immunoreactiviteit verbeteren en ultrastructuur behouden <sup> 3-5.

Tissue fixatie is een cruciaal onderdeel van EM studies. Fixatieven chemisch verknopen de macromoleculen om het weefsel structuren te vergrendelen. De keuze van fixatief beïnvloedt niet alleen structurele conservering maar ook antigeniciteit en contrast. Osmiumtetroxide (OSO _4), formaldehyde en glutaaraldehyde zijn de standaard fixatieven decennia, met inbegrip van het centrale zenuwstelsel (CNS) weefsels die vooral gevoelig voor structurele schade tijdens chemische of fysische bewerkingen. Helaas OSO ₄ is zeer reactief en is aangetoond dat maskeren antigenen ^6, resulterend in slechte en onvoldoende labeling. Alternatieve benaderingen van chemische fixatie te vermijden onder meer het bevriezen van de weefsels. Maar deze technieken zijn moeilijk en vereisen dure apparatuur. Om sommige van deze problemen aan te pakken en CZS etikettering Phend et al. verbeteren. vervangen OSO ₄ met uranylacetaat (UA) en tannine acid (TA), en met succes bijkomende wijzigingen van de gevoeligheid van antigeen en structurele conservering hersenen en ruggenmerg weefsels ⁷ verbeteren. We hebben deze osmium-vrij na inbedding methode om ratten hersenweefsel en geoptimaliseerd de immunogoud etikettering techniek voor het opsporen en bestuderen synaptische eiwitten.

We presenteren hier een methode om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen te bepalen. We maken gebruik van organotypische hippocampus gekweekte plakjes. Deze schijfjes handhaven van de trisynaptic circuit van de hippocampus, en zijn dus vooral handig voor het bestuderen van synaptische plasticiteit, een mechanisme in brede kring te leren en geheugen ten grondslag liggen. Organotypische hippocampale plakken van postnatale dag 5 en 6 muizen / ratten worden bereid zoals eerder beschreven ⁸ en zijn bijzonder nuttig om acute knockdown of overexpressie exogene eiwitten. We hebben eerder gebruikt dit protocol om characterize neurogranin (Ng), een neuron-specifiek eiwit een kritische rol in het reguleren synaptische functie ^8,9. We hebben ook gebruikt om de lokalisatie van ultrastructurele calmoduline (CaM) en Ca ^{2 +} / CaM-afhankelijke proteïne kinase II (CaMKII) ¹⁰ karakteriseren. Zoals weergegeven in de resultaten, dit protocol zorgt voor een goede ultrastructurele behoud van dendritische spines en efficiëntie-etikettering van Ng te helpen karakteriseren te verspreiden over de rug ^8. Bovendien is de hier beschreven procedure kan brede toepasbaarheid hebben bij het bestuderen van vele andere eiwitten betrokken bij neuronale functies.