תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס
Summary
הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.
Abstract
מיקרוסקופיה Immunoelectron היא כלי רב עצמה כדי לחקור מולקולות ביולוגיות ברמת subcellular. נוגדנים מצמידים את סמני אלקטרונים צפופים כגון זהב colloidal יכולים לחשוף את הלוקליזציה וההפצה של אנטיגנים ספציפיים ברקמות שונות 1. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר הן-הטבעה של לפני או אחרי הטבעת טכניקות. במיקרוסקופיה טכניקות הטבעה מראש immunogold אלקטרונים (EM), הרקמה יש permeabilized כדי לאפשר חדיר נוגדן לפני שהוא משובץ. טכניקות אלה הן אידיאליות לשימור מבנים, אך חדירה נמוכה של הנוגדנים (לעתים קרובות רק כמה מיקרומטרים 1) היא חסרון ניכר 2. שיטות התיוג לאחר ההטבעה יכולות להימנע מבעיה זו, כי התיוג מתרחש בחלקים של רקמות קבועות בי אנטיגנים הם יותר נגישה בקלות. במהלך השנים מספר השינויים שפרו את השיטות שלאחר ההטבעה כדי לשפר immunoreactivity ולשמר ultrastructure <sup> 3-5.
קיבעון רקמה הוא חלק חיוני של לימודיהם. Fixatives כימי Crosslink מקרומולקולות לנעול את מבני רקמות במקום. הבחירה מקבעת משפיעה לא רק על שימור מבנים, אלא גם antigenicity וניגוד. tetroxide אוסמיום (אוסו 4), פורמלדהיד, וglutaraldehyde כבר את fixatives הרגיל במשך עשרות שנים, כוללים למערכת עצבים מרכזיות (CNS) רקמות הנוטות במיוחד לניזק מבני במהלך עיבוד כימי ופיזי. למרבה הצער, אוסו 4 הוא מאוד תגובתי והוכח כדי להסוות אנטיגנים 6, וכתוצאה מהתיוג גרוע ובלתי מספק. גישות חלופיות כדי למנוע קיבוע כימי כוללות הקפאת הרקמות. אבל טכניקות אלה הן קשות לביצוע ודורש מכשור יקר. כדי לענות על חלק מהבעיות הללו ולשפר את תיוג רקמות מערכת עצבים מרכזיים, Phend et al. החליף Oso 4 עם תצטט uranyl (UA) וACI טאניד (ת"א), והציג שינויים נוספים בהצלחה כדי לשפר את הרגישות של זיהוי אנטיגן ושימור מבנים במוח וברקמות בעמוד שדרת 7. אנחנו אמצנו שיטת אוסמיום זה ללא לאחר ההטבעה לרקמת מוח חולדה ואופטימיזציה טכניקת התיוג immunogold לזהות וללמוד חלבונים סינפטיים.
אנו מציגים כאן שיטה כדי לקבוע את הלוקליזציה של חלבונים סינפטיים ultrastructural בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה. אנו משתמשים בפרוסות תרבית היפוקמפוס organotypic. פרוסות אלה לשמור מעגלי trisynaptic של ההיפוקמפוס, ולכן הם יעילים במיוחד לחקירת פלסטיות הסינפטית, מנגנון מקובל לראות בבסיס למידה וזיכרון. פרוסות ביפוקמפוס Organotypic מיום 5 ו 6 גורים לאחר לידת עכבר / עכברוש יכולות להיות מוכנות כפי שתואר לעיל 8, ושימושיים במיוחד לחריפות מציאה או חלבונים אקסוגניים overexpress. יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה בעבר לפרקaracterize neurogranin (נג), חלבון נוירון ספציפי עם תפקיד קריטי בויסות תפקוד הסינפטי 8,9. יש לנו גם השתמשנו בו כדי לאפיין את הלוקליזציה של ultrastructural calmodulin (רמ"א) וCa 2 + חלבון / CAM תלוי קינאז השני (CaMKII) 10. כפי שמודגם בתוצאות, פרוטוקול זה מאפשר שימור ultrastructural טוב של קוצים הדנדריטים ותיוג יעיל של נג לעזור לאפיין ההפצה שלה בעמוד השדרה של 8. יתר על כן, התהליך המתואר כאן יכול להיות תחולה רחבה בחקר חלבונים רבים אחרים שהיו מעורבים בפונקציות עצביות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מאמצים את שיטת Phend ויינברג למוח ורקמות בעמוד שדרה כדי ללמוד קוצים הדנדריטים בתרבויות פרוסות ביפוקמפוס חולדה. קוצים הדנדריטים באזור היפוקמפוס CA3-CA1 הם מבנים עדינים המכילים מגוון עצום של חלבונים שממלאים תפקידים חשובים בויסות תפקודים עצביים. השיטה הוצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למתיו פירנצה להכנה של התרבויות הפרוסות ביפוקמפוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי להזדקנות בארה"ב ואיגוד האלצהיימר לNZG.
Materials
| NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5′-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).
