Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media
Summary
Monitorización de la perfusión cerebral se ha demostrado para mejorar la precisión en modelos de ictus isquémicos. Las dificultades técnicas a menudo limitan el uso de esta herramienta esencial para la investigación cerebrovascular. En este vídeo, un sistema optimizado se muestra para obtener una monitorización hemodinámica única o multi-sitio durante la oclusión intraluminal de la arteria cerebral en ratas.
Abstract
El potencial de traslación de la investigación preclínica carrera depende de la precisión de los modelos experimentales. Monitorización de la perfusión cerebral en modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico agudo permite confirmar la oclusión arterial éxito y no incluyen hemorragia subaracnoidea. Monitorización de la perfusión cerebral también puede ser usado para estudiar la circulación colateral intracraneal, que está surgiendo como un poderoso factor de pronóstico del accidente cerebrovascular y un posible objetivo terapéutico. A pesar de un reconocido papel de supervisión Laser Doppler perfusión en el marco de las directrices actuales para la isquemia cerebral experimental, una serie de dificultades técnicas existentes que limitan su uso generalizado. Uno de los principales problemas es la obtención de una fijación segura y prolongada de una profunda penetración de la sonda de láser Doppler en el cráneo animal. En este video, mostramos nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral durante la oclusión transitoria de la arteria cerebral media por filamento intraluminal en la rata. Hemos desarrollado in-casa de un método simple para obtener un soporte hecho a medida para doble fibra (profundidad de penetración) láser sondas Doppler, que permiten multi-sitio de monitoreo si es necesario. Una vigilancia continua y prolongada de la perfusión cerebral puede ser fácilmente obtenido en el cráneo intacto.
Introduction
Investigación traslacional sobre los factores hemodinámicos que afectan a la fisiopatología y el tratamiento trazo debe aplicarse, ya que esta cuestión importante es a menudo descuidado paradójicamente por estudios de investigación básica 1.
Monitorización de la perfusión cerebral es una herramienta esencial, pero infrautilizado, para modelar con precisión el accidente cerebrovascular isquémico 2. Aparte de la confirmación de la oclusión del vaso arterial y la exclusión de la hemorragia subaracnoidea 3, la supervisión continua de perfusión cerebral puede proporcionar datos útiles sobre el grado y la consistencia de déficit de perfusión, el estado funcional de los vasos colaterales intracraneales y el efecto hemodinámico de nuevos enfoques terapéuticos.
Un estudio reciente de nuestro grupo indican que el control hemodinámico multi-sitio puede ser utilizada para evaluar la circulación colateral intracraneal y puede predecir el tamaño del infarto y déficit funcional 4. Estos resultados experimentales son consistent con estudios clínicos que demostraron que el rendimiento funcional de la circulación colateral cerebral es predictivo de la evolución clínica en pacientes con ictus isquémico 5, 6. Por esta razón, los colaterales cerebrales se han recomendado como una potencial diana terapéutica en la fase aguda del accidente cerebrovascular isquémico 7.
Laser-Doppler (LD) Los instrumentos son la herramienta más utilizada para medir la perfusión cerebral en el ictus isquémico experimental y su uso está recomendado por las guías recientes sobre el tema 8. LD instrumentos miden la perfusión microvascular en un pequeño volumen cortical, la profundidad de la señal grabada ser dependiente de la anchura de separación de las fibras, con dos sondas de fibra LD permitiendo una penetración más profunda en comparación con las sondas de fibra única LD 9. Los valores de flujo de sangre se expresan como unidades arbitrarias de perfusión (PU) que indican relativa en lugar de absoluta flujo sanguíneo cerebral. Calibración de PU se realiza generalmente usinnormas g motilidad, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. LD flujometría permite un monitoreo continuo dinámico y la generación de datos cuantitativos dentro de la misma sesión.
Entre los problemas técnicos que actualmente limitan el uso de LD, una cuestión importante es la obtención de un apego seguro y prolongado de una profunda penetración de la sonda láser Doppler en el cráneo animal. Esto es esencial para el control prolongado y si se utilizan varias sondas para diferentes territorios arteriales cerebrales, ya que estamos llevando a cabo en nuestro laboratorio.
En particular, el tiempo quirúrgico prolongado es necesaria si las sondas están unidas al cráneo utilizando orificios de trepanación o tornillos craneales, mientras que la señal pobre y la unión no segura se produce si sola fibra (baja penetración) LD sondas están unidas al cráneo mediante cola quirúrgica simple. Gemelas de fibra (de penetración profunda) sondas LD proporcionar una señal mayor y más consistente, pero son más grandes que las sondas de fibra individuales, no puede ser entached en el cráneo con pegamento quirúrgico solamente.
En este video, mostramos nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral durante la oclusión transitoria de la arteria cerebral media por filamento intraluminal en la rata. Se describe un método simple para obtener una eficiente, personalizado titular hecho, de bajo costo para un solo o múltiples de doble fibra (profundidad de penetración) sondas de LD, que se utilizará para el seguimiento prolongado de la perfusión cerebral durante el cráneo intacto.
El procedimiento quirúrgico para MCAO transitoria en la rata podría ser visto en el video-artículo de Uluc y compañeros de trabajo 10 y no se muestra en este vídeo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado internamente un sistema simple y de bajo costo para una fijación segura de una o varias sondas de doble fibra LD (penetración profunda) en el cráneo intacto de ratas durante el procedimiento MCAO. Aunque al parecer un problema trivial, la obtención de una fijación fiable de la sonda de LD al cráneo es realmente un problema importante en esta configuración experimental, ya que es el requisito previo para una detección de señal suave y un control exitoso de la perfusión cerebral.
Los procedimientos invasivos, tales como trepanaciones y tornillos para huesos, por lo general prolongar el tiempo quirúrgico e introducir más variables experimentales relacionados con la craneotomía, y esto puede desalentar a los investigadores y los que se abstengan de utilizar el seguimiento LD. Por otro lado, el uso de una sola fibra (baja penetración) sondas, que son más delgados y más fácil relativamente a ser pegado directamente a la superficie del cráneo, da de baja calidad de la señal y no puede utilizarse de forma fiable con ratas adultas sin la perforación o adelgazamiento del cráneo.
Se utilizaron materiales simples y de bajo costo, tales como caucho natural, tubos de plástico y un estilete de metal. Un soporte de sonda de medida se puede producir en unos pocos minutos y adaptado a las condiciones experimentales. Estos titulares de la sonda puede alojar uno o más de profundidad de penetración sondas LD, para el control clásico único sitio en el núcleo isquémico o para múltiples sitios de monitoreo en diferentes territorios arteriales en el mismo hemisferio o en los dos hemisferios. Muchos titulares de la sonda podría ser producido, esterilizar químicamente, y se almacena para uso futuro. Veterinario aprobado por pegamento quirúrgico (cianoacrilato), acelerado por aire frío, se utiliza para unir el soporte de la sonda a la superficie intacta de la calavera de rata, de acuerdo con las coordenadas deseadas craneales. Finalmente, la sonda puesta a punto se ve asegurada en su lugar por medio de suturas comunes.
El tiempo total de esta sonda LD puesta en marcha, después de dominar esta técnica, es de aproximadamente 10 min.
Como he mostradon este vídeo, de manera rutinaria controlar la perfusión cerebral en el territorio central MCA (LD sonda 1: núcleo isquémico) y en el periférico territorio MCA (LD sonda 2: principalmente una zona de penumbra). En nuestro estudio reciente mostró que la variabilidad de los cambios de flujo sanguíneo en LD sonda 2 (media 52% ± 16% SD, en comparación con la línea de base) es mayor en comparación con LD sonda 1 (media 31% ± 6% SD, en comparación con la línea de base) y puede ser usado para predecir 4 pronóstico del accidente cerebrovascular.
Podemos proporcionar algunos consejos de solución de problemas para los investigadores que deseen utilizar nuestro propio sistema desarrollado. Al comienzo del experimento, tener cuidado para secar muy bien la superficie del cráneo (con Merbromina y el aire frío) antes de fijar el soporte de la sonda para evitar el desprendimiento prematuro. Además, asegúrese de aplicar la cola sobre el caucho natural, evitando el contacto con el extremo abierto del tubo de plástico y la superficie óptica de la sonda de LD, para evitar que la señal pobre y el daño potencial a la sonda. Al atar la sutura alrededor de la cabeza del animal, tenga cuidado para evitar la obstrucción de las vías respiratorias (esto se evita mediante la colocación de la sutura en el hueso mandibular). Después de colocar y asegurar las sondas, tenga cuidado de no cables de las sondas de tracción al girar el animal en decúbito supino para la cirugía cervical, este paso suele requerir dos personas, una persona que tiene el animal y una segunda persona que sostiene los cables de las sondas y suavemente colocando a la posición deseada. Finalmente, eventual contaminación de la sangre de la sonda de doble fibra de LD se maneja fácilmente siguiendo las instrucciones de limpieza proporcionadas por el fabricante.
Nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral, como se muestra en este video, podría ser una alternativa más fácil, más rápido y más fiable a la sonda puesta a punto de sistemas que se venden actualmente por empresas comerciales en este campo. Además, creemos que el uso de este sistema por otros investigadores pueden mejorar el espárragoy de la hemodinámica cerebral en el accidente cerebrovascular experimental campo, que conducen al desarrollo de una nueva generación de agentes terapéuticos colaterales cerebrales.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a la Sra. Caroline Robertson por la voz en off y la señora Elena Pirovano por su ayuda en la producción de video. Este estudio fue apoyado por la Universidad de Milano Bicocca, "Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor | Moor Instruments | ||
| VP12 probe | Moor Instruments | ||
| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers |
References
- Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia. J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).
- Prinz, V., Endres, M., Dirnagl, U. Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview. Rodent models of stroke. , (2010).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Riva, M., Pappadà, G. B., et al. Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke. Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).
- Menon, B. K., Smith, E. E., et al. Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions. Am. J. Neuroradiol. 32, 1640-1645 (2011).
- Bang, O. Y., et al. Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 42, 693-699 (2011).
- Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target. Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Shepherd, A. P., Öberg, P. A. . Laser-Doppler Blood Flowmetry. , (1990).
- Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke. 26, 627-634 (1995).
