Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal
Summary
Monitorização da perfusão cerebral foi demonstrada para melhorar a precisão em modelos de isquemia AVC. Dificuldades técnicas, muitas vezes limitam o uso desta ferramenta essencial para a pesquisa vascular cerebral. Neste vídeo, um sistema optimizado é mostrado para obter um controlo único ou multi-local hemodinâmicas durante a oclusão da artéria cerebral média intraluminal em ratos.
Abstract
O potencial de translação de pesquisa pré-clínica AVC depende da precisão de modelação experimental. Monitorização da perfusão cerebral em modelos animais de acidente vascular cerebral isquémico agudo permite confirmar a oclusão arterial bem sucedido e não incluem hemorragia subaracnóide. Monitorização da perfusão cerebral também pode ser utilizado para estudar a circulação colateral intracraniana, a qual está a emergir como um poderoso determinante de acidente vascular cerebral e resultado de um possível alvo terapêutico. Apesar de um reconhecido papel de monitorização da perfusão Laser Doppler como parte das diretrizes atuais de isquemia cerebral experimental, uma série de dificuldades técnicas existentes que limitam o seu uso generalizado. Uma das questões principais é a obtenção de uma ligação segura e prolongada de uma penetração profunda Laser Doppler sonda ao crânio animal. Neste vídeo, mostramos o nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral durante a oclusão da artéria cerebral média por passageiro filamento intraluminal no rato. Nós desenvolvemos in-casa de um método simples para obter um suporte feito sob encomenda para dupla fibra (penetração profunda) sondas laser Doppler, que permitem multi-site de monitoramento, se necessário. A monitorização contínua e prolongada de perfusão cerebral pode facilmente ser obtida sobre o crânio intactos.
Introduction
Investigação translacional em fatores hemodinâmicos que afetam fisiopatologia AVC e terapia precisa ser implementada, uma vez que esta importante questão é muitas vezes negligenciada por paradoxalmente pesquisas básicas 1.
Monitorização da perfusão cerebral é uma ferramenta essencial, mas pouco utilizado, para a modelagem de acidente vascular cerebral isquêmico preciso 2. Além da confirmação da oclusão do vaso arterial e exclusão de hemorragia subaracnóide 3, monitorização da perfusão contínua cerebral pode fornecer informações úteis sobre o grau de consistência e de déficit de perfusão, o estado funcional dos vasos colaterais intracranianos e o efeito hemodinâmico de novas abordagens terapêuticas.
Um estudo recente do nosso grupo indicam que a monitorização hemodinâmica multi-site pode ser utilizado para avaliar a circulação colateral intracraniana e pode prever o tamanho do infarto e déficit funcional 4. Estes resultados experimentais são consistent com estudos clínicos, que mostraram que o desempenho funcional da circulação colateral cerebral é preditivo de resultado clínico em pacientes com derrame isquêmico 5, 6. Por esta razão, colaterais cerebrais foram recomendadas como um alvo terapêutico potencial na fase aguda do acidente vascular cerebral isquêmico 7.
Laser-Doppler (LD) instrumentos são a ferramenta mais comum usado para medir a perfusão cerebral no AVC isquémico experimental e seu uso é recomendado pelas diretrizes recentes sobre este tema 8. LD instrumentos perfusão microvascular medida num pequeno volume cortical, a profundidade do sinal gravado ser dependente da largura de separação de fibras, com sondas de fibras individuais LD, permitindo uma penetração mais profunda em comparação com sondas de fibra única LD 9. Os valores de fluxo de sangue estão expressos como unidades arbitrárias de perfusão (PU), que indicam a relação, em vez de o fluxo de sangue cerebral absoluto. Calibração de PU é normalmente realizada usinpadrões de motilidade de g, de acordo com as instruções do fabricante. LD fluxometria permite um acompanhamento contínuo e dinâmico e geração de dados quantitativos dentro da mesma sessão.
Entre os problemas técnicos que atualmente limitam o uso do LD, uma questão importante é a obtenção de uma ligação segura e prolongada de uma penetração profunda Laser Doppler sonda ao crânio animal. Isto é essencial para a monitorização prolongada e se várias sondas são utilizadas para diferentes territórios arteriais cerebrais, como estamos realizando em nosso laboratório.
Em particular, o tempo cirúrgico prolongado é necessário se as sondas estão ligadas ao crânio utilizando orifícios da rebarba ou parafusos cranianos, enquanto sinal fraco e fixação insegura ocorre se as sondas de fibra única (menor penetração) LD estão ligados ao crânio por meio de cola cirúrgica simples. Duplos fibra sondas (penetração de profundidade) LD fornecer um sinal maior e mais consistente, mas eles são maiores do que as sondas de fibra única e não pode ser menosapenso ao crânio utilizando apenas cola cirúrgica.
Neste vídeo, mostramos o nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral durante a oclusão da artéria cerebral média por passageiro filamento intraluminal no rato. Descreve-se um método simples para se obter uma eficiente, feito, de baixo custo para titular único ou múltiplo de dupla fibra (penetração profunda) sondas de LD, a ser utilizado para monitorização prolongada da perfusão cerebral intacta sobre o crânio.
O procedimento cirúrgico para a MCAO transiente no rato pode ser visto no vídeo, artigo por Uluc e colaboradores 10 e não é mostrado neste vídeo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós desenvolvemos em casa um sistema simples e de baixo custo para uma fixação segura de uma ou várias sondas twin-fibras (penetração profunda) LD para o crânio intacto de ratos durante o processo de OACM. Embora, aparentemente, um problema trivial, a obtenção de uma fixação de confiança da sonda de LD para o crânio é, na verdade, um problema importante nesta configuração experimental, uma vez que é o pré-requisito para a detecção de sinal suave e um controlo bem sucedido de perfusão cerebral.
Procedimentos invasivos, como buracos rebarbas e parafusos de osso, geralmente prolongar o tempo cirúrgico e introduzir mais variáveis experimentais relacionados a craniotomia, e isso pode desencorajar os investigadores e abster-se-os de utilizar monitoramento LD. Por outro lado, a utilização de fibra única (baixa penetração) sondas, que são mais finas e relativamente fácil de ser colada directamente à superfície do crânio, dá baixa qualidade de sinal e não pode ser utilizado de modo fiável com ratos adultos sem perfurar ou desbaste do crânio.
Usamos materiais simples e de baixo custo, como a borracha natural, tubos de plástico e um estilete de metal. Um suporte de sonda feito por encomenda pode ser produzido em poucos minutos e adaptada às condições experimentais. Estes suportes de sonda pode acomodar uma ou mais sondas de penetração profunda LD, para o monitoramento local clássico único no núcleo isquêmico ou para vários sites de monitoramento em diferentes territórios arteriais no mesmo hemisfério ou entre os dois hemisférios. Muitos proprietários de sonda pode ser produzida quimicamente esterilizada e armazenado para uso futuro. Veterinário-aprovado cola cirúrgica (cianoacrilato), acelerada por ar frio, é utilizado para fixar o suporte da sonda para a superfície intacta do crânio de ratos, de acordo com as coordenadas desejadas cranianos. Finalmente, a sonda de montagem está ainda fixado no seu lugar por meio de suturas comuns.
O tempo total desta sonda LD set-up, depois de dominar esta técnica, é de cerca de 10 min.
Como mostrado in Neste vídeo, rotineiramente monitorar a perfusão cerebral na ACM centro território (LD sonda 1: núcleo isquêmico) e no periférico MCA território (LD sonda 2: principalmente uma área de penumbra). No nosso estudo recente mostrou-se que a variabilidade de alterações do fluxo sanguíneo em LD sonda 2 (média de 52% ± 16%, SD, em comparação com a linha de base) é superior em comparação com a sonda 1 LD (média de 31% ± 6% SD, em comparação com o linha de base), e podem ser usados para predizer 4 resultado derrame.
Podemos fornecer alguns conselhos de resolução de problemas para os pesquisadores que gostariam de usar nosso sistema desenvolvido internamente. No início da experiência, ter o cuidado de secar muito bem a superfície do crânio (com merbromin e ar frio), antes de fixar o suporte da sonda para evitar o descolamento prematuro. Além disso, certifique-se de aplicar a cola sobre a borracha natural, evitando o contacto com a extremidade aberta do tubo de plástico e a superfície óptica da sonda de LD, para evitar que o sinal fraco, o potencial para a sonda. Quando atar o fio de sutura em volta da cabeça do animal, ter cuidado a fim de evitar a obstrução das vias aéreas (isto é impedido pelo posicionamento do fio de sutura ao longo do osso da mandíbula). Depois de posicionar e fixar as sondas, tome cuidado para não cabos das sondas de tração ao girar o animal em decúbito dorsal para a cirurgia cervical; esta etapa geralmente requer duas pessoas, uma pessoa segurando o animal e uma segunda pessoa segurando os cabos das sondas e gentilmente posicionando-os para a posição desejada. Finalmente, contaminação sanguínea eventual do twin-LD sonda de fibra é de fácil manuseio, seguindo as instruções de limpeza fornecidas pelo fabricante.
Nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral, como mostra este vídeo, pode oferecer uma alternativa mais fácil, mais rápido e mais confiável para a sonda de set-up de sistemas que são vendidos atualmente por empresas comerciais nesta área. Além disso, acreditamos que a utilização deste sistema por outros investigadores pode aumentar o pernoy de hemodinâmica cerebral no campo experimental acidente vascular cerebral, que conduzem ao desenvolvimento de uma nova geração de agentes terapêuticos colaterais cerebrais.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sra. Caroline Robertson para o voice-over e Elena Sra. Pirovano por sua ajuda na produção de vídeo. Este estudo foi financiado pela Universidade de Milano Bicocca ", Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor | Moor Instruments | ||
| VP12 probe | Moor Instruments | ||
| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers |
References
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