Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch
Summary
Eine einfache Methode, um extrazelluläre Feldpotentiale in der larvalen Zebrafisch Vorderhirn aufnehmen beschrieben. Das Verfahren bietet eine robuste<em> In vivo</em> Auslesen der Beschlagnahme-artige Aktivität. Diese Technik kann mit gentechnisch veränderten Zebrafischlarven tragenden Epilepsie-verwandten Genen oder Anfälle durch Verabreichung von Medikamenten Konvulsivum evozierten verwendet werden.
Abstract
Epilepsie betrifft fast 3 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und bis zu 50 Millionen Menschen weltweit. Definiert als das Auftreten von spontanen Anfällen unprovozierten kann Epilepsie als Folge einer Beleidigung zum Gehirn oder einer genetischen Mutation erworben werden. Die Bemühungen um Modell Anfälle bei Tieren haben vor allem genutzt Beleidigungen (convulsant Drogen, Stimulation oder Hirnverletzungen) und genetische Manipulationen (Antisense-knockdown, homologe Rekombination oder Transgenese) in Nagetieren erworben. Zebrafische sind ein Wirbeltier Modellsystem 1-3, die eine wertvolle Alternative zur Nagetier-basierte Epilepsieforschung bieten könnte. Zebrafische sind ausführlich in der Studie von Wirbeltier Genetik oder Entwicklung verwendet werden, weisen einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit genetischen Säugetieren und exprimieren Homologe für ~ 85% der bekannten menschlichen monogene Epilepsie Mutationen. Aufgrund ihrer geringen Größe (4-6 mm lang), kann Zebrafischlarven in Fluidvolumen so niedrig wie 100 ul werden während der frühen Entwicklung und arra gepflegtlungsgehilfen Multi-Well-Platten. Reagenzien können direkt zu der Lösung in dem Embryonen entwickeln, die Vereinfachung Arzneimittelverabreichung und die eine rasche in-vivo-Screening von Testverbindungen 4 zugesetzt werden. Synthetische Oligonukleotide (Morpholinos), Mutagenese, Zink-Finger-Nuklease und transgene Ansätze können verwendet werden, um rasch zu einer Gen-knockdown oder Mutation im Zebrafisch 5-7 werden. Diese Eigenschaften leisten Zebrafisch Studien eine beispiellose statistische Analyse Vorteil gegenüber Nagetieren in der Studie von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie. Da der "Goldstandard" für Epilepsie Forschung ist es, zu überwachen und zu analysieren abnorme elektrische Entladungen, die in einer zentralen Struktur des Gehirns (dh, Krampfanfälle), ein Verfahren zur effizienten Aufnahme Hirnaktivität in larvalen Zebrafisch stammen wird hier beschrieben. Diese Methode ist eine Anpassung der herkömmlichen extrazellulären Aufnahmetechniken und ermöglicht einen stabilen langfristigen Überwachung der Hirnaktivität in intakten Zebrafisch-Larven. Sreichlich Aufnahmen werden für akute Anfälle durch Bad Anwendung convulsant Drogen und spontane Anfälle in einem genetisch veränderten Fischen aufgenommen induzierte gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die extrazelluläre Aufzeichnung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sehr sensitive und schnelle Analyse der Hirnaktivität. Diese Aufnahmen sind analog zu elektroenzephalographischen (EEG) Überwachen häufig verwendet, um das Vorhandensein von anormalen elektrischen Entladung (dh Anfall) in Nagetier-Modellen von Epilepsie 11 und 12 Patienten auszuwerten. Extrazelluläre Aufnahmen können mit pharmakologischen Manipulationen kombiniert werden, wie hier gezeigt. Diese Arten von Aufz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor möchte Peter Castro und Matthew Dinday für ihre frühen Bemühungen, Zebrafisch im Labor zu etablieren danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health EUREKA-Stipendium (# R01NS079214-01) finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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