الدماغ الأمامي تسجيل الكهربية في الزرد اليرقات
Summary
ووصف طريقة بسيطة لتسجيل إمكانات حقل خارج الخلية في الدماغ الأمامي الزرد اليرقات. الأسلوب يوفر قوية<em> في الجسم الحي</em> قراءة من الاستيلاء على غرار النشاط. ويمكن استخدام هذه التقنية مع يرقات اسماك الزرد المعدلة وراثيا تحمل جينات الصرع ذات الصلة أو المضبوطات أثار من قبل إدارة الأدوية الاختلاج.
Abstract
الصرع يؤثر على ما يقرب من 3 ملايين شخص في الولايات المتحدة ويصل إلى 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. يعرف بأنه حدوث النوبات دون سابق استفزاز عفوية، يمكن الحصول على الصرع نتيجة لإهانة إلى الدماغ أو طفرة جينية. الجهود المبذولة لضبط النموذج في المقام الأول تستخدم الحيوانات والشتائم المكتسبة (المخدرات الاختلاج، أو إصابات الدماغ التحفيز) والتلاعب الجيني (ضربة قاضية العقاقير، إعادة التركيب مثلي أو transgenesis) في القوارض. الزرد هي نظام نموذجي الفقاريات 1-3 التي يمكن أن توفر بديلا قيما للابحاث ومقره القوارض الصرع. وتستخدم على نطاق واسع الزرد في دراسة علم الوراثة الفقاريات أو التنمية، يحمل درجة عالية من التشابه الجيني للثدييات والتعبير عن homologs ل85٪ ~ من الطفرات المعروفة الإنسان بالصرع واحد الجينات. بسبب صغر حجمها (4-6 ملم في الطول)، يمكن الحفاظ على الزرد اليرقات في حجم السائل منخفضة تصل إلى 100 ميكرولتر خلال التنمية في وقت مبكر والأذربيجانيةYED في موضوع لوحات جيدة. يمكن إضافة الكواشف مباشرة إلى الحل الذي الأجنة تطوير وتبسيط إدارة المخدرات وتمكين الفحص السريع في الجسم الحي من المركبات اختبار 4. ويمكن استخدام أليغنوكليوتيد] الاصطناعية (morpholinos)، الطفرات والزنك الاصبع نوكلياز والنهج المعدلة وراثيا لتوليد بسرعة ضربة قاضية أو طفرة في الجين الزرد 5-7. تحمل هذه الخصائص الدراسات الزرد لم يسبق له مثيل تحليل القوة الإحصائية ميزة على القوارض في دراسة الاضطرابات العصبية مثل الصرع. لأن "معيار الذهب" للأبحاث الصرع هو رصد وتحليل غير طبيعية الإفرازات الكهربائية التي تنشأ في بنية الدماغ المركزية (أي، نوبات)، وهي طريقة لتسجيل نشاط المخ بكفاءة في الزرد اليرقات يوصف هنا. هذا الأسلوب هو التكيف من تقنيات التسجيل التقليدية خارج الخلية ويسمح لرصد طويل الأجل مستقرة من نشاط المخ في يرقات اسماك الزرد سليمة. Sوتظهر التسجيلات وافرة للمضبوطات الحادة التي تنتج عن تطبيق حمام المخدرات الاختلاج ونوبات عفوية سجلت في الأسماك المعدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تسجيل خارج الخلية المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة من نشاط المخ. هذه التسجيلات هي مشابهة لرصد (EEG) تخطيط كهربية تستخدم عادة لتقييم وجود التفريغ الكهربائي غير طبيعي (أي الاستيلاء) في نماذج القوارض من الصرع 11 و 12 مريضا. ويمكن الجمع بين التسج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن المؤلف أن يشكر بيتر كاسترو وDinday ماثيو لجهودهم في وقت مبكر لإقامة الزرد في المختبر. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EUREKA (# R01NS079214-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
