السريرية تطبيق<em> الجمال النائم</em> ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية
Summary
وغرست الخلايا T تعبر عن CD19 محددة مستضد خيالية مستقبلات (CAR)، والعلاج الفحص من الأورام الخبيثة الخلايا B-من خلال موقعنا الأول في التجارب البشرية العلاج الجيني. وصفنا التعديل الوراثي للخلايا T باستخدام<em> الجمال النائم</em> (SB) لإدخال نظام CD19 محددة CAR ونشر انتقائي على الخلايا مصمم CD19 + مستضد تقديم الاصطناعي.
Abstract
يمكن تحسين فعالية الخلايا T-السريرية الصف من خلال الجمع بين العلاج الجيني مع العلاج المناعي لهندسة منتج بيولوجي مع إمكانية الاعتراف (ط) متفوقة من الورم المستضدات المرتبطة (TAAs)، (الثاني) بعد استمرار التسريب، (الثالث) إمكانية الهجرة إلى مواقع الأورام، و (رابعا) القدرة على إعادة تدوير وظائف المستجيب داخل الورم المكروية. وقد استخدمت معظم النهج للتلاعب الجيني للخلايا T هندسيا للتطبيق الارتجاعي الإنسان والفيروسة البطيئة للتعبير مستقرة. 1-3 CAR. هذا النهج، على الرغم متوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (GMP)، ويمكن أن تكون مكلفة لأنها تعتمد على تصنيع وإطلاق السريرية الصف فيروس المؤتلف من عدد محدود من مرافق الإنتاج. نقل الكهربائية من البلازميدات nonviral هو بديل جذاب لتنبيغ منذ الأنواع يمكن أن تنتج DNA إلى الصف السريرية في حوالي 1/10 ال تكلفة recombinالنمل GMP الصف الفيروس. لتحسين كفاءة التكامل أننا تكييفها الجميلة النائمة (SB) ينقول وtransposase لتطبيق 4-8 الإنسان. نظامنا يستخدم SB البلازميدات DNA اللذين تتكون من ينقول الترميز لجين ذات الاهتمام (مثل الجيل الثانية 2 CD19 محددة التحوير CAR، CD19RCD28 المعينة) وtransposase (مثل SB11) الذي يدرج في التحوير ثنائي النوكليوتيد TA يكرر 9-11 . لإنشاء أرقام سريريا ذاتيا من الخلايا T المعدلة وراثيا التي نستخدمها K562 المستمدة من الخلايا مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC) (استنساخ # 4) تعديل للتعبير عن TAA (مثل CD19) وكذلك جزيئات الخلية costimulatory T CD86، CD137L، وهو غشاء محدد إصدار انترلوكين (IL) -15 (الببتيد تنصهر المنطقة لتعديل التيسير IgG4) وCD64 (FC-γ مستقبلات 1) لتحميل الاجسام المضادة (ماب) 12. في هذا التقرير، إلا أننا شرح الإجراءات التي يمكن القيام بها في compliaNCE مع المركب لتوليد CD19 محددة CAR + T الخلايا البشرية المناسبة للتطبيق. وقد تحقق ذلك من قبل متزامن الكهربائية نقل البلازميدات DNA اثنين، ينقول SB (CD19RCD28) وtransposase SB (SB11)، يليه استرجاع integrants مستقرة من قبل كل الإضافات-7-اليوم (دورة التحفيز) من γ-المشع AAPC (استنساخ # 4) في حضور IL-2 للذوبان الإنسان المؤتلف و 13 IL-21. وتجري عادة 4 دورات (28 يوما للثقافة مستمر) لإنشاء أرقام سريريا-T جاذبية من الخلايا التي تعبر عن ثابت جمهورية أفريقيا الوسطى. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لتصنيع الخلايا السريرية الصف T-CD19 محددة لخلايا T المستمدة من الدم المحيطي (PB) أو دم الحبل السري (UCB). وعلاوة على ذلك، يمكن تسخير هذا النهج لتوليد خلايا T لأنواع الأورام المختلفة من إقران خصوصية CAR المقدمة مع التعبير عن TAA، معترف بها من قبل CAR، على AAPC.
Protocol
Representative Results
Discussion
ينقول ونظم transposase، مثل من piggyBac 12،19 وSB 18،20-22، غير أن النهج للفيروسات العلاج الجيني التي هي بديل لالفيروسي بوساطة تنبيغ من CAR الصف السريرية + الخلايا التائية. تم اختيار SB كما نقل الجين نظام يعتمد على قدرته على العلاج الجيني البشري 1،6،23. قمنا بتطوير التكنولوجيات المزدوجة للتبديل SB (لإدخال CAR) وإضافة العودية من γ-المشع AAPC (لاسترداد خلايا T المعدلة وراثيا معربا عن ثابت سيارة) لتكون بمثابة منصة التقنيات في صناعة الخلايا T-TAA محددة في الامتثال مع المركب للمرحلة I / II التجارب (الشكل 4). بعد 28 يوما (أربعة دورات التحفيز لمدة 7 أيام) من الثقافة المشتركة على γ-المشع AAPC، ونحن عادة ما تكون قادرة على توليد ما لا يقل عن 10 10 ~ خلايا T المعدلة وراثيا مناسبة للتطبيقات الإنسان. حسب الحاجة، ويمكن القيام دورات التحفيز إضافية رس توليد أعداد أكبر من الخلايا T المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، إذا كانت هناك حاجة أقل CAR + T الخلايا، يمكن تحجيم النهج المتبع في الصعق الكهربائي وانتشار توظيف عدد أقل من عودة cuvettes والمضي قدما مجرد مجموعة فرعية من الخلايا T وتوسعت عدديا لجولات لاحقة من انتشار على AAPC في بداية كل دورة التحفيز. electroporated غالبية خلايا T ونشر حصاد للتسريب التعبير عن ثابت جمهورية أفريقيا الوسطى. آل إليه CD4 + + CD8 الخلايا وT معربا عن جيلنا الثانية 2 CAR تشمل خلايا الذاكرة مع النمط الظاهري / ساذجة وسيعرض ثلاث بصمات إعادة توجيه خصوصية. أولا، T الخلايا المعدلة وراثيا على وجه التحديد الأهداف ليز + CD19، وثانيا، إنتاج الإنترفيرون γ استجابة لمحفز الخلايا CD19 + وثالثا، تتكاثر ردا على CD19 + الخلايا المغذية، كل بطريقة CAR-تعتمد 13،18. لدينا نهج لintegrيمكن القيام بها يأكلون التحوير CAR عن طريق التحويل الكهربائي من البلازميدات DNA غير الفيروسية من النظام SB في الخلايا T هادئة الأولية المستمدة من PB وUCB. عدلت وراثيا وغيرها ونحن K562 الخلايا لتكون بمثابة AAPC للنشر الأرقام بكفاءة سريريا ذاتيا من الخلايا T للتسريب 24،25. لقد تم AAPC والأنسجة البيئة ثقافة (مثل إضافة IL-21) قد تم تعديلها لتوليد المريض والجهات المانحة المستمدة CD19 خلايا T محددة للتسريب بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (الجدول 1) 13،18. نحن يمكن ان تنتج خلايا T + CAR من PB حصل ببساطة عن طريق بزل الوريد الذي يتجنب تكلفة، وعدم الراحة، والحصول على إزعاج MNC من PB بواسطة فصادة. القدرة على استخلاص عدد كبير من الخلايا T + CAR من أعداد صغيرة من MNC جذابة بشكل خاص لغرس الخلايا T بعد زرع خيفي UCB. صغر حجم وعدم الكشف عن الجهة المانحة يحول دون إعادة حديثي الولادة-الوصول إلى هذا الشخص في وقت لاحق نقطة وأرقام محدود فقط من الشركات متعددة الجنسيات المقطوع تتوفر المواد اللازمة لبدء تصنيع الخلايا T لتجنب التداخل مع تكون الدم. مزيد من التقدم في عملية التصنيع يتم تنفيذها حاليا لتشمل الصعق الكهربائي و جهاز إنتاجية عالية إلى جانب وجود مفاعل حيوي WAVE مغلقة تماما للحد من التعامل معها. في مجموعها، وSB وAAPC جذابة لتوليد منصات CD19 محددة CAR + T الخلايا التي يمكن تكييفها لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا T المعدلة وراثيا التي يمكن التعرف البديلة سطح الخلية TAAs في الامتثال المركب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كارل يونيو (جامعة بنسلفانيا) لمساعدة توليد وتوفير استنساخ AAPC رقم 4 والدكتور بيري هاكيت (جامعة مينيسوتا) للحصول على مساعدة مع نظام SB.
منحة الدعم: منح مركز السرطان الأساسية (CA16672)؛ RO1 (CA124782، CA120956، CA141303)؛ R33 (CA116127)؛ P01 (CA148600)؛ SPORE (CA136411)، وألبرت J وارد المؤسسة؛ بوروز ويلكوم الصندوق؛ Gillson Longenbaugh المؤسسة؛ الوقاية من السرطان ومعهد بحوث تكساس؛ CLL مؤسسة أبحاث العالمية؛ زارة الدفاع؛ العقارية من Noelan L. Bibler؛ هاري T. Mangurian، الابن، صندوق لعلاج مناعي اللوكيميا؛ معهد علاج السرطان شخصية؛ اللوكيميا سرطان الغدد الليمفاوية والمجتمع؛ الغدد اللمفاوية مؤسسة البحوث؛ MDACC شقيقة مؤسسة شبكة الصندوق؛ ميلر مؤسسة، والسيد هيرب سيمونز، والسيد والسيدة جو H. الموازين، والسيد توماس سكوت، المؤسسة الوطنية لأبحاث السرطان، أمراض الأطفال مؤسسة أبحاث السرطان؛ Assistanc الإنتاجه لالعلاجات الخلوية (PACT)؛ وليام لورانس ومؤسسة هيوز بلانش للطفولة.
Materials
| Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
| Reagents | |||||||||||||||
| DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
| PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
| CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
| HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
| Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
| Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
| Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
| CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
| FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
| APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
| PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
| PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
| Disposables | |||||||||||||||
| 12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
| T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
| Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||
| Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
| Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
| Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
| Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |
|||||||||||||||
References
- Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
- Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
- Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
- Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
- Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
- Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
- Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
- Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
- Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
- Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
- Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
- Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
- Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
- Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
- Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
- Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
- Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
- Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
- Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
- Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
- Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
- Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).
