יישום קליני של<em> יפהפה נרדם</em> ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים
Summary
תאי T מבטאים רצפטור אנטיגן chimeric CD19 ספציפי (CAR) הם חדורים כטיפול investigational של ממאירויות B-cell בניסויים בריפוי הגנטי הראשונים ב-האנושיים שלנו. אנו מתארים שינוי גנטי של תאי T באמצעות<em> יפהפה נרדם</em> מערכת (SB) להציג CAR CD19 ספציפי והפצה סלקטיבית על מעצב CD19 + תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים.
Abstract
העצמה של תאי T קליני כיתה ניתן לשפר על ידי שילוב של טיפול גנטי עם טיפול חיסוני למהנדס מוצר ביולוגי עם הפוטנציאל להכרה מעולה (אני) של אנטיגנים הקשורים גידול (TAAs), (ii) התמדה לאחר עירוי, (iii) פוטנציאל להגירה לאתרי גידול ויכולת (ד) למחזר פונקציות מפעיל במייקרו הגידול. רוב הגישות למניפולציה גנטית של תאי T המהונדס ליישום אנושי השתמשו רטרווירוס וlentivirus לביטוי היציב של CAR 1-3. גישה זו, אם כי בקנה אחד עם פרקטיקת ייצור טובה נוכחית (GMP), יכול להיות יקרה כמו שהיא מסתמכת על הייצור ושחרורו של וירוס רקומביננטי קליני כיתה ממספר מוגבל של מתקני ייצור. העברת אלקטרו של פלסמידים nonviral היא חלופה מושכת לתמרה מאז ניתן לייצר מיני DNA לכיתה קלינית בכ 1/10 ה עלות recombinוירוס הנמלה GMP בכיתה. כדי לשפר את היעילות של שילוב התאמנו יפהפה נרדמים (SB) transposon וtransposase ל4-8 יישום אנושיים. מערכת SB שלנו משתמשת בשני פלסמידים DNA שמורכבים מtransposon קידוד לגן של עניין (2 דור nd למשל transgene CAR-CD19 ספציפי, המיועדים CD19RCD28) וtransposase (למשל SB11) אשר מוסיף לtransgene dinucleotide ת"א חוזר 9-11 . כדי לייצר מספר קליני מספיק של תאי T-מהונדס גנטי שאנו משתמשים בתאי K562-derived מלאכותיים מציגי אנטיגן (aAPC) (שיבוט # 4) השונים להביע TAA (למשל CD19), כמו גם את מולקולות costimulatory תאי T CD86, CD137L, גרסת קרום נכנס של (IL) אינטרלוקין -15 (פפטיד התמזג לאזור Fc modified IgG4) וCD64 (FC-γ קולט 1) לטעינה של נוגדנים חד שבטי (MAB) 12. בדו"ח זה, אנו מדגימים את ההליכים שיכולים להתבצע בcompliaNCE עם cGMP לייצר מכונת CD19 + תאים ספציפיות המתאימים ליישום אנושי T. זה הושג על ידי אלקטרו העברה סינכרונית של שני פלסמידים DNA, SB transposon (CD19RCD28) וSB transposase (SB11) ואחרי שהליפה של integrants היציב על ידי תוספות כל-7-היום (מחזור גירוי) של aAPC γ-מוקרן (שיבוט המס '4) בנוכחות של IL-2 המסיס רקומביננטי האנושי ו-IL-21 13. בדרך כלל 4 מחזורים (28 ימים של התרבות הרציפה) הם התחייבו לייצר מספר קליני מושך-של תאי T שמבטאים יציבות הרכב. מתודולוגיה זו לייצור תאי T קליני כיתה CD19 ספציפיים יכולה להיות מיושמת על תאי T שמקורם הדם היקפי (PB) או דם טבורים (UCB). יתר על כן, גישה זו ניתן לרתום ליצירת תאי T לסוגי גידולים שונים על ידי זיווג הספציפי של המכונית שהוצגה בביטוי של TAA, מוכר על ידי המכונית, בaAPC.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכות transposase, כגון מpiggyBac 12,19 וSB 18,20-22, Transposon וגישות שאינן נגיפים לריפוי גנטי שאלטרנטיבה לתמרת ויראלי בתיווך של מכונת כיתה קלינית + תאי T. SB נבחר כמערכת העברת הגנים המבוססת על הפוטנציאל שלו לריפוי גנטי אנושי 1,6,23. אנחנו פתחנו את הטכנולוגיות הכפולות של טרנספוזיציה SB (להציג CAR) ובנוסף רקורסיבית של aAPC γ-מוקרן (כדי לאחזר תאי T מהונדס גנטי ביציבות להביע CAR) לשמש כפלטפורמת טכנולוגיות בייצור תאי T TAA ספציפיים בעמידה עם cGMP לשלב I / II של ניסויים (איור 4). לאחר 28 יום (ארבעה מחזורי גירוי 7-יממה) של שיתוף התרבות בaAPC γ-מוקרן, אנחנו בדרך כלל מסוגלים להפיק לפחות ~ 10 10 תאים T מהונדס גנטי מתאימים ליישומי אדם. בהתאם לצורך, מחזורי גירוי נוספים יכולים להתבצע to לייצר מספר גדול יותר של תאי T מהונדס גנטי. יתר על כן, אם תאי T CAR פחות + יש צורך, הגישה לelectroporation והתפשטות וניתן לשנות בחזרה העסקת cuvettes פחות וביצוע סט משנה רק מתאי T התרחב מספרי לסיבובים הבאים של התפשטות על aAPC קדימה בתחילתו של כל מחזור גירוי. רוב electroporated ומופץ תאי T שנקטפו לעירוי ביציבות להביע את המכונית. התולדה של CD4 + ו CD8 + תאי T מבטאים CAR הדור nd 2 שלנו כוללת תאים עם פנוטיפ זיכרון / נאיבי ולהציג 3 סימני היכר של ייחוד מחדש ביים. ראשית, תאי T המהונדס גנטי ספציפיים lyse CD19 + מטרות, ושנית, לייצר IFN-γ בתגובה לCD19 + תאי ממריץ ושלישיים, מתרבים בתגובה לCD19 + תאים מזינים, כולם באופן CAR תלוי 13,18. הגישה שלנו לintegrאכלתי transgene CAR על ידי אלקטרו העברת פלסמידים DNA שאינם נגיפיים ממערכת SB יכול להתבצע בתאי T רדומים עיקריים הנגזרים מPB וUCB. אנחנו ואחרים שינה K562 תאים גנטיים לשמש כaAPC ליעילות קלינית להפיץ מספרים מספיקים של תאי T-לעירוי 24,25. AAPC וסביבת תרביות רקמה (לדוגמה: התוספת של IL-21) כבר הותאמו ליצירת מטופל והתורם נגזר-CD19 תאי T ספציפיים לעירוי לאחר השתלת תאי הגזע hematopoietic (לוח 1) 13,18. אנחנו יכולים לייצר מכונית + תאי T מPB פשוט מתקבלים על ידי venipuncture אשר ימנע את העלות, אי נוחות וחוסר הנוחות של קבלת MNC מPB ידי אפרזיס. היכולת להפיק כמויות גדולות של מכונית + תאי T ממספר קטן של MNC במיוחד מושכת ליציקת תאי T לאחר אלוגנאית UCB השתלה. הגודל ואנונימיות קטן של תורם היילודים מונעים מחדש-גישה לאדם זה בנקודת זמן מאוחר יותר, ורק מספר מוגבל של נקטף MNC זמין כחומר מוצא לייצור התאים T כדי להימנע מלהפריע לhematopoiesis. התקדמות נוספת בתהליך הייצור היא כרגע בעיצומו שיכלול מכשיר electroporation תפוקה גבוהה בשילוב עם bioreactor גל סגור לגמרי כדי למזער טיפול. במצטבר, SB וaAPC פונים פלטפורמות ליצירת מכונת CD19 ספציפית + תאי T שניתן להתאים לייצר מספר רב של תאי T מהונדס גנטי שיכול לזהות TAAs החלופי על פני קרום תא בעמידה בcGMP.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר קרל יוני (אוניברסיטת פנסילבניה) לעזרה ביצירה ומתן שיבוט aAPC # 4 ו ד"ר פרי אקט (אוניברסיטת מינסוטה) לעזרה עם מערכת SB.
תמיכת גרנט: מרכז הסרטן Core גרנט (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); אלברט J וורד קרן; בורוז Wellcome קרן; Gillson Longenbaugh קרן; מניעת הסרטן ומכון מחקר של טקסס; CLL הגלובלי קרן מחקר; משרד ההגנה; עזבון Noelan L. Bibler; הארי ט Mangurian בן, קרן לוקמיה חיסונית; מכון לריפוי בסרטן אישית; וקמיה ולימפומה אגודה; קרן מחקר לימפומה; אחותו של MDACC הרשת המוסדית הקרן; מילר הקרן; מר רב סימונס; מר וגברת ג'ו ח הסולמות; מר תומס סקוט; הקרן הלאומית לחקר הסרטן, קרן לחקר סרטן בילדים; Assistanc הפקהדואר לטיפולים תאיים (PACT); קרנה של בלאנש יוז ילדי ויליאם לורנס ו.
Materials
| Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
| Reagents | |||||||||||||||
| DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
| PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
| CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
| HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
| Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
| Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
| Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
| CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
| FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
| APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
| PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
| PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
| Disposables | |||||||||||||||
| 12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
| T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
| Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||
| Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
| Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
| Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
| Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |
|||||||||||||||
References
- Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
- Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
- Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
- Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
- Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
- Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
- Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
- Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
- Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
- Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
- Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
- Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
- Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
- Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
- Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
- Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
- Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
- Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
- Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
- Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
- Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
- Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).
