GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em> Drosophila</em> Oosit

1. Diseksiyon için Sinekler hazırlanması Eski bir haftadan daha kısa olan arzu edilen genotip (örneğin, bir GFP-etiketli protein eksprese eden) sağlıklı sinekleri anestetize. Yuvarlak krem ​​renkli karınları ile 10-15 büyük kadın seçin. Yeni hafifçe mayalı gıda ihtiva eden bir şişeye, seçilen sinekler ve birkaç (3-5) erkek aktarın ve sinekler 25 ° C'de iki gün boyunca beslemek izin vermek Drosophila hazırlanması ile ilgili ayrıntılar için Weil ve diğ. 6'ya bakınız. Besi sinekler aşamalarında çeşitli, özellikle aşamaları 8-12, görüntüleme için kullanılabilir olmasını sağlar. Kötü besiye veya unfattened genellikle sadece çok erken dönemlerinde (1-6) ve olgun (evre 14) oosit içeren uçar. 2. Dik Bileşik Mikroskop Kullanarak Görüntüleme için Oosit hazırlanması Silikon greas kullanarak, yaklaşık 1 cm aralıklı, slayt iki lamelleri koymak suretiyle standart bir cam slayt hazırlayıne. Sadece lamel ve slayt arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak için yeterli gres kullanmayın. Her lamel bastırarak ince ve eşit gres yayılacak. Lamelleri ve slayt arasındaki noktada bazı Halokarbon yağı 27 (Sigma) ekleyin. Bunlar sonraki adımlarda izole oosit yaralanmasına önlemek için ayırıcılar olarak hizmet edecektir. No 1.5 lamelleri geç evre oositlerin eşleştiğini ortalama kalınlığı (0,16-0,18 mm) ile, iyi çalışır. 22 mm'lik 2 lamel yüzeyi üzerinde yer halokarbon yağ 27. 2-3 damla. Mümkün olan sağlıklı oosit elde etmek için tek başına bir dişi ağız pipetleme ile gıda tüpten çıkarıldı ve hafifçe anestezi olmadan önce halokarbon yağ yatırılır. Keskin diseksiyon forseps (örneğin Dumont # 5 gibi) kullanarak, lamel karşı sinek bacağına ve karın ucu çekin. Petrol altında, lamel yüzeyi boyunca sürükleyerek yumurtalık çıkarın. Bu adhesio teşvik edeceğizn lamel oositlerin. Yavaşça oogenezisin en az evre 10B olan oositlerin arıyor, yumurtalıklar dışında tease. Bu aşamada Oosit oosit yumurta odasının toplam hacminin en az% 50-60 kapladığı yumurta odaları arayan tarafından tespit edilebilir. Bu noktada hayvanlardaki anda, oosit örten folikül hücreleri kolumnar olur ve hemşire hücrelere bağlantıları kalır küçük bir bölge hariç her tarafta oosit çevreleyen var. Ovariole kılıf bireysel oosit kaldırmak için forseps kullanın. 5-8 hasarsız oosit lamel izole edilene kadar, 1-3 dişiler kullanarak, devam edin. Herhangi unuseable doku çıkarın. Dikkatlice oosit iki aralayıcı arasında konumlandırılmış şekilde önceden hazırlanmış slayt üzerine oosit içeren lamel ters. Bu oositlerin zarar verecektir ters lamel aşağı basmayın. Gerekirse, t halokarbon yağ az miktarda eklemek"sandviç" arasında o kenarlarında boşluk sağlamak için doldurulur. (Opsiyonel:. Lamel yerleşme için izin vermek için birkaç dakika için slayt dinlendirin) slayt artık görüntüleme için hazırdır. 3. Bir Ters Bileşik Mikroskop Kullanarak Görüntüleme için Oosit hazırlanması Oosit yerine lamelleri arasında kullanılan bir cam alt uç (Mattek, 35 mm) ile bu küçük Petri yemekler hariç, esas olarak Bölüm 2'de anlatılan disseke edilir. Bu örnek kapsayacak şekilde gereksiz ve diseksiyon sonrası, doku yemekler doğrudan yansıması olabilir, ancak bakım oosit yağ ile kaplı ve kurumasına izin verilmez kalmasını sağlamak için alınmalıdır. 4. Görüntüleme Canlı DIC veya faz kontrast optikler kullanılarak odak içine bir yumurta getir ve bu sitoplazma sızıntı veya folikül hücreleri şişkin olarak hasar herhangi bir işaret için oosit inceleyin. Sağlıklı ve hasarsız görünen Resim yalnızca oosit. Streasitoplazmada yumurta sarısı veziküllerin 7 autofluorescent olduğundan lama, GFP etiketleme için gerek olmaksızın, doğrudan izlenebilir. Bu sinyal kapsamı FITC aralığında yakalanabilir ama büyük olasılıkla GFP etiketli proteinlerin için kullanılandan daha yüksek kazanç ayarları gerektirir. Akışının en iyi görüntü sadece cam lamel / cam petri karşı duran bir yumurtanın yüzeyinin altında olan optik kesit elde edilir. İşte oosit biraz odak daha iyi bir uçak için yapım, düzleştirilir. Görüntüleri 200X de çekilebiliyor – 1,000 X. Lamel oosit ve objektif arasında bir bariyer oluşturur yana düzenleme kullanarak burada açıklanan, hava hedefleri kullanılmalıdır. Büyük ölçüde örnek sürüklenme ve hareketi en aza indirir, çünkü bu en uygunudur. Ilgilenilen bölge odak sonra, brighfield optik kapatın ve konfokal görüntüleme geçmek. Yazılım hızlı tarama / önizleme fonksiyonunu kullanarak, odak ayarı ve kazançGerekirse. Yakalama ayarları mikroskop mikroskop değişir, ancak genel parametreleri aşağıdaki gibidir: ~ 488 nm dalgaboyu ve ~ 515 nm dalgaboyuna kullanın. Z ekseni Z ekseni çerçeve arasında 10 saniyelik bir gecikme ile sabit kalır, böylece yakalama ayarlayın. Oosit dururken ve odak düzlemi uygun sağlamak için 5-10 kare bir test dizisi yakalayın. Tipik bir zaman atlamalı dizisi 20 arasında yakalayacaktır – 50 kare ve video kalitesini değerlendirmek için tamamlanmasından hemen sonra gözden geçirilebilir. Işlem slayt diğer hücreleri için tekrar edilebilir, ya da gerektiğinde ek parçalara dişi olabilir. 5. Sorun Giderme ve Ortak Sorunlar Drift – dik bir mikroskop kullanılarak, hücreler bazen nedeniyle petrol yayılmasına kayması olabilir. Bu lamel altındaki alanı kapsayacak şekilde sadece yeterli yağ kullanılarak minimize edilebilir. Sorun devam ederse, daha az silikon g kullanınslayda yapıştırmayın ayırıcılar için rease. Not: Bazı konfokal yazılım paketleri hücre izleme için izin verir, ama genel olarak sürüklenen oosit görüntüleme terk edip onun yerine başka bir örnek kullanmak daha iyidir. Hiçbir akarsu belirtileri – akış belirgin değilse, büyük olasılıkla iki nedenlerinden biri nedeniyle, ya resim çekimi için odak düzlemi doğru değil (genellikle yumurtanın içine çok derin) veya oosit hasarlı. Zaman ve pratik hem hataları en aza indirebilirsiniz.