Een protocol voor levende beeldvorming van GFP-gemerkte eiwitten of autofluorescerende structuren in afzonderlijke<em> Drosophila</em> Oöcyten beschreven.
De Drosophila eicel is opgericht als een veelzijdig systeem voor het onderzoeken van fundamentele vragen, zoals cytoskelet functie, cel organisatie en organel structuur en functie. De beschikbaarheid van verschillende GFP-gemerkte eiwitten betekent dat vele cellulaire processen kunnen worden gevolgd in levende cellen in de loop van minuten of uren, en het gebruik van deze techniek, zijn processen zoals RNP transport, epitheliale morfogenese en weefselombouw beschreven in detail in Drosophila oöcyten 1,2.
De mogelijkheid om video imaging gecombineerd met een rijke repertoire van mutanten uit te voeren kan een enorme verscheidenheid van genen en processen te onderzoeken in ongelooflijk veel details. Een voorbeeld hiervan is het proces van het ooplasmic streaming, die het initiatiefrecht heeft halverwege de oögenese 3,4. Deze krachtige beweging van cytoplasmatische vesikels is microtubuli en kinesine-afhankelijke 5 en biedt een nuttige systeem voor onderzoek cytoskelet functie in deze fasen.
Hier presenteer ik een protocol voor time lapse imaging van levende eicellen met behulp van vrijwel elke confocale microscopie setup.
Drosophila oöcyten zijn een veelzijdige modelsysteem voor het adresseren van een verscheidenheid van vragen met betrekking tot de functie en organisatie van cellen en subcellulaire componenten. Een volledig begrip van eiwit functie vereist de controle op zowel ruimtelijke en temporele aspecten van eiwitten gedrag. Advances in zowel beeldvorming en de genetische beschikbare instrumenten Drosophilists het mogelijk ook kleine labs van hoge kwaliteit imaging experimenten in levende oöcyten. Here I schetsen een protocol om het gedrag van GFP-gemerkte of autofluorescerende eiwitten te analyseren bij midden-tot late-oögenese die kunnen worden gebruikt in combinatie met verschillende genetische achtergronden van eiwitfunctie sonde.
In dit protocol I beschrijven het proces waarbij eicellen worden bereid voor beeldvorming en de basis confocale instellingen verkrijging van tijdsverloop video van fluorescerende eiwitten en structuren mogelijk maken. Extra details met eicel preparaat beschreven door Weil et al.. 6 A uiteenlopende fly stammen die eiwitten die endogeen zijn gecodeerd via exon-trapping beschikbaar 8 en oneindig eiwitvarianten kunnen worden ontworpen en opnieuw te vliegen.
In het werken met levend weefsel, de gezondheid van de exemplaren van het allergrootste belang. Egg kamers van het podium 10B kunnen voltooien oögenese in een in wezen autonome mode 11, waardoor ze ideaal zijn voor de korte termijn imaging studies. Zorg moet worden genomen op een aantal belangrijke stappen om gegevens van hoge kwaliteit te krijgen. Tijdens dissectie is het belangrijk om eierstokken en eicellen manipuleren zo min mogelijk en de tijd tussen dissectie en de voltooiing van imaging minimaliseren. Idealiter zou een kleine dissectie station zich in dezelfde kamer die de confocale scope herbergt, en slechts enkele eieren kamers tegelijk worden afgebeeld. Het aantal hier aanbevolen (5-8) Zorgt ervoor dat dissectie tijd geminimaliseerd wordt terwijl het maximaliseren van de kans op het verkrijgen van een goede kwaliteit foto's. Ik raad het vastleggen van een korte reeks beelden om de beeldkwaliteit te beoordelen en dat de opname-instellingen worden geoptimaliseerd, voor het vastleggen van een langere time lapse volgorde te bevestigen. De meeste software stelt individuele frames worden opgeslagen, en deze beelden kunnen dan worden geanalyseerd op verschillende manieren met ImageJ 12 of andere software.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies GM096076 van de NIH AREA programma.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
#5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |