الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من<em> في الجسم الحي</em> أنظمة التجريبية.
Abstract
ضرورة أساسية للباحثين الذين يدرسون الحصانة التكيف مع نماذج تجريبية في الجسم الحي هو القدرة على تحديد الخلايا T T بهم على أساس خلية مستقبلة المستضد (TCR) خصوصية. العديد من الطرق غير المباشرة التي تتوفر في عدد سكانها ويتم تحفيز الخلايا T الأكبر من في المختبر مع مستضد معين وحاتمة محددة خلايا T وتحديدها من خلال قياس استجابة وظيفية مثل انتشار الأسلحة النووية، إنتاج السيتوكينات، أو التعبير عن علامات التنشيط 1. ومع ذلك، هذه الأساليب تحديد حاتمة محددة فقط خلايا T واظهار واحدة من العديد من الوظائف المحتملة، وأنها ليست حساسة بما يكفي للكشف عن خلايا محددة حاتمة T على ترددات السلائف السذاجة. وثمة بديل شعبية هو المعدلة وراثيا TCR نموذج نقل بالتبني، والتي هي خلايا T المصنف حيدة النسيلة من الماوس المعدلة وراثيا في TCR المضيفين متوافق نسيجيا لخلق السكان السلائف كبير من الخلايا T-حاتمة محددة يمكن أن تكون EASIلي مع تعقب استخدام الأجسام المضادة علامة 2،3 مسانج مشترك. بينما قوية، وهذه الطريقة يعاني من التحف التجريبية المرتبطة تردد من الخلايا T unphysiological مع خصوصية لحاتمة واحدة 4،5. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن تستخدم هذا النظام للتحقيق في عدم التجانس الوظيفي للحاتمة محددة استنساخ الخلايا T للسكان من بولكلونل.
يجب أن الطريقة المثلى لدراسة الحصانة التكيف تنطوي على الكشف المباشر للحاتمة محددة خلايا T T من مرجع الخلية المحلية باستخدام أسلوب الذي يميز خصوصية TCR فقط من قبل ملزم لالمشابهة الببتيد: مجمعات MHC (PMHC). استخدام tetramers PMHC والتدفق الخلوي يحقق هذا 6، ولكن يقتصر على الكشف عن السكان تيرة عالية من الخلايا T-حاتمة محددة لا توجد إلا مستضد التالية التي يسببها التوسع نسيلي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تنسق استخدام tetramers PMHC وماغنيتيك تكنولوجيا تخصيب الخلية لتمكين الكشف عن خلايا T التردد المنخفض للغاية حاتمة محددة من الأنسجة اللمفاوية 3،7 الماوس. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن تتبع شامل كامل حاتمة محددة من الخلايا T السكان الذاتية في الفئران في جميع مراحل الاستجابة المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وtetramer PMHC تخصيب خلية مقرها طريقة التي قدمها هذا البروتوكول هو أداة قوية لدراسة حاتمة محددة خلايا T من الخلايا T الذاتية ذخيرة. استخدام tetramers PMHC تمكن الكشف عن خلايا T حاتمة محددة تستند مباشرة على قدرة TCRs لربط يغاندس PMHC وما شابه ذلك. إثراء يوفر مستوى من الحساسية بحيث يمكن ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر اندريه هان والين لورانس للمساعدة التقنية، وأعضاء المختبر جنكينز للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
