מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em> דרוזופילה</em
Summary
כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים ב<em> דרוזופילה</em> במהלך זיהום חיידקים, כמו גם את היכולת של זבובים לעלות תגובה חיסונית על ידי ניטור הישרדות, עומס בקטריאלי, ופעילות בזמן אמת של רגולטור מפתח של חסינות מולדת, NFκB.
Abstract
יחסי גומלין מורכבים בין התגובה החיסונית והתנהגות מארח כבר תאר במגוון רחב של מינים. עודף שינה, בפרט, ידועה להתרחש כתגובה לזיהום ביונקים 1 ויש גם לאחרונה תוארה בדרוזופילה melanogaster 2. הדעה מקובלת היא, שהשינה מועילה למארח במהלך זיהום ושזה חשוב לשמירה על מערכת חיסונית חזקה 3,4. עם זאת, ראיות ניסיוניות שתומכות בהשערה זו הן מוגבלת 4, ותפקיד השינה עודפת במהלך תגובה חיסונית עדיין לא ברור. יש לנו להשתמש בגישה רבה תחומית לטיפול בבעיה מורכבת זו, ובצעו מחקרים במערכת הפשוטה הגנטית המודל, פריזבוב דרוזופילה melanogaster. אנו משתמשים בבדיקה סטנדרטית למדידת התנהגות ושינה של תנועה בזבובים, ולהדגים כיצד בדיקה זו משמשת למדידת התנהגות בזבובים infecteד עם זן הפתוגני של חיידקים. בדיקה זו היא גם שימושית עבור ניטור משך ההישרדות בזבובים בודדים במהלך זיהום. צעדים נוספים של תפקוד מערכת חיסון כוללים את היכולת של זבובים כדי לנקות דלקת וההפעלה של NFκB, גורם שעתוק מפתח שהוא מרכזי בתגובה החיסונית המולדת בדרוזופילה. שניהם תוצאת הישרדות ופינוי במהלך זיהום חיידקים ביחד הם אינדיקטורים של התנגדות וסובלנות לזיהום. התנגדות מתייחסת ליכולת של זבובים כדי לנקות זיהום, תוך סובלנות מוגדרת כיכולתו של המארח כדי להגביל את הניזק מזיהום ובכך לשרוד למרות רמות גבוהות של הפתוגן בתוך המערכת 5. ניטור בזמן אמת של פעילות NFκB במהלך הזיהום מספק תובנה מנגנון מולקולרי של הישרדות במהלך זיהום. השימוש בדרוזופילה במבחנים הפשוטים הללו מאפשר הניתוח הגנטי ומולקולרי של שינהואת התגובה החיסונית ואיך שתי מערכות מורכבות אלה מושפעים הדדיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את גישתו לחקור כיצד התנהגות, במיוחד לישון, קשורה לפרמטרי תגובה חיסוניות. פרמטרים אלה כוללים עומס חיידקים, תוצאות הישרדות, ופעילות NFκB כפי שנמדד על ידי עיתונאי לוציפראז in vivo. יחד פרמטרים אלה מספקים מידע על אופן שגם זבוב יכול להילחם בזיהום. עומס חיי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומי למדע במסגרת מענק # IOS-1025627 ועל ידי המכון הלאומי לבריאות במסגרת המענק # 1R21NS078582-01 ללסת
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
References
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
- Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
- Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
- Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
- Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
- Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
- Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
- Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
- Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
- Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
- Wu, L. P., Choe, K. -. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
- Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
- Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
- Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
- Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Allee, W. C. . The social life of animals. , (1938).
- Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
- Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).
