Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en<em> Drosophila</em
Summary
Pour comprendre le lien entre la réponse immunitaire et le comportement, nous décrivons une méthode pour mesurer le comportement locomoteur dans<em> Drosophila</em> Lors d'une infection bactérienne ainsi que la capacité des mouches à monter une réponse immunitaire par la survie de surveillance, la charge bactérienne, et en temps réel l'activité d'un régulateur clé de l'immunité innée, NFkB.
Abstract
Une interaction complexe entre la réponse immunitaire et comportement de l'hôte a été décrit dans un large éventail d'espèces. L'excès de sommeil, en particulier, est connu pour se produire en réponse à l'infection chez les mammifères 1 et a récemment été décrit chez Drosophila melanogaster 2. Il est généralement admis que le sommeil est bénéfique à l'hôte lors d'une infection et qu'il est important pour le maintien d'un système immunitaire robuste 3,4. Cependant, les preuves expérimentales qui soutient cette hypothèse est limité 4, et la fonction du sommeil en excès au cours d'une réponse immunitaire reste incertaine. Nous avons utilisé une approche multidisciplinaire pour s'attaquer à ce problème complexe, et ont mené des études dans le système modèle génétique simple, la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster. Nous utilisons un test standard pour mesurer le comportement locomoteur et de sommeil chez les mouches, et de montrer comment ce test est utilisé pour mesurer le comportement des mouches infected avec une souche pathogène de bactéries. Ce test est également utile pour contrôler la durée de survie chez les mouches individuels au cours d'une infection. D'autres mesures de la fonction immunitaire incluent la capacité de mouches pour effacer une infection et l'activation de NFkB, un facteur de transcription clé qui est au cœur de la réponse immunitaire innée chez la drosophile. Résultats à la fois la survie et la clairance bactérienne au cours de l'infection ainsi que des indicateurs de résistance et de tolérance à l'infection. Résistance réfère à la capacité des mouches pour effacer une infection, tandis que la tolérance est définie comme la capacité de l'hôte à limiter les dommages causés par une infection et ainsi survivre en dépit des niveaux élevés d'agents pathogènes au sein du système 5. Surveillance en temps réel de l'activité de NFkB cours de l'infection permet de mieux comprendre un mécanisme moléculaire de survie lors de l'infection. L'utilisation de la drosophile dans ces essais simples facilite les analyses génétiques et moléculaires de sommeilet la réponse immunitaire et la manière dont ces deux systèmes complexes sont mutuellement influencés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une approche pour étudier la façon dont le comportement, en particulier dormir, est liée à des paramètres de la réponse immunitaire. Ces paramètres comprennent la charge bactérienne, les résultats de survie et l'activité NFKB, mesurée par un rapporteur luciférase in vivo. Ensemble, ces paramètres fournissent des informations sur la façon dont une mouche peut combattre une infection. Charge bactérienne et les résultats de survie sont des paramètres de la réponse immunit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation Grant # 1025627 IOS et par le National Institutes of Health en vertu subvention no 1R21NS078582-01 à JAW
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
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