Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Durante gli ultimi anni, il contributo delle cellule alveolari di tipo II epiteliali (AECII) a vari aspetti della regolazione immunitaria nel polmone è stato sempre più riconosciuto. AECII hanno dimostrato di partecipare alla produzione di citochine in vie aeree infiammate ed agire anche come cellule presentanti l'antigene sia infezione e cellule T mediata autoimmunità ^1-8. Pertanto, essi sono particolarmente interessanti anche in contesti clinici, quali vie aeree iper-reattività estera e di auto-antigeni così come le infezioni che direttamente o indirettamente si rivolgono AECII. Tuttavia, la nostra comprensione delle funzioni immunologiche dettagliate serviti da cellule alveolari di tipo II epiteliali nel polmone sano così come in infiammazione rimane frammentario. Molti studi in materia di funzione AECII vengono eseguite utilizzando il mouse o umani linee cellulari epiteliali alveolari ^9-12. Lavorando con linee cellulari offre sicuramente una serie di vantaggi, come la disponibilità di grandi numeri of cellule per analisi approfondite. Tuttavia, riteniamo che l'uso di primaria AECII murino permette una migliore comprensione del ruolo di questo tipo di cellule in processi complessi come infezione o infiammazione autoimmune. Primaria AECII murino possono essere isolati direttamente da animali affetti da tali disturbi respiratori, nel senso che sono stati sottoposti a tutti gli altri fattori estrinseci che giocano un ruolo nel contesto analizzato. Come esempio, AECII vitali possono essere isolate da topi infettati intranasale con virus influenzale A, che colpisce principalmente queste cellule per la replicazione ^13. È importante sottolineare che, attraverso l'infezione ex vivo di AECII isolati da topi sani, gli studi sulle risposte cellulari montati su di infezione può essere ulteriormente estesa.

Nostro protocollo per l'isolamento di primaria AECII murino si basa sulla digestione enzimatica del polmone topo seguita da etichettare la sospensione cellulare risultante con anticorpi specifici per CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 e CD16/CD32. AECII granulari vengono identificate come la dispersione non marcato e lateralmente alta (SSC ^alta) popolazione cellulare e sono separati da fluorescenza activated cell smistamento ^3.

In confronto ai metodi alternativi di isolare cellule epiteliali primarie da polmoni di topo, il nostro protocollo per l'isolamento di citometria a flusso AECII per selezione negativa produce intatta, altamente puro AECII vitale e in tempi relativamente brevi. Inoltre, e in contrasto con i metodi convenzionali di isolamento di panning e deplezione dei linfociti tramite legame di anticorpo-accoppiati biglie magnetiche ^{14, 15,} citometria a flusso di cellule ordinamento consente discriminazione attraverso dimensione cellulare e granularità. Dato che la strumentazione per selezione cellulare citofluorimetrica è disponibile, la procedura descritta può essere applicata a costi relativamente bassi. Accanto a anticorpi standard e enzimi per la disintegrazione del polmone, senza reagenti aggiuntivi, come magneticoperline sono richiesti. Le cellule isolate sono adatti per un'ampia gamma di studi funzionali e molecolari, che comprendono la coltura in vitro di cellule T e saggi di stimolazione così come trascrittoma, proteoma o analisi secretoma ^{3, 4.}