בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים
Summary
אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.
Abstract
במהלך השנים האחרונות, התרומה של תאי שומן מסוג II (אפיתל AECII) להיבטים שונים של רגולציה בחיסון הריאות הוכרה יותר ויותר. AECII הוכח להשתתף בייצור ציטוקינים בנשימה מודלקת ואפילו לפעול כהצגת אנטיגן תאים הוא בזיהום והתפתחות מחל תאי T תיווך 1-8. לכן, הם מעניינים במיוחד גם בהקשרים קליניים כגון-תגובתיות היפר נשימה לזרה ו- אנטיגנים עצמיים, כמו גם זיהומים שבמישרין או בעקיפין למקד AECII. עם זאת, ההבנה של הפונקציות החיסוניות המפורטות מוגשות על ידי תאי האפיתל סוג II במכתשיים הריאה הבריאה כמו גם בדלקת שלנו נשארת חלק. מחקרים רבים בנוגע לתפקוד AECII מתבצעים באמצעות עכבר או שורות תאי אפיתל מכתשיים אדם 9-12. עבודה עם שורות תאים בהחלט מציעה מגוון של הטבות, כגון זמינות של מספר גדול of תאים לניתוחים נרחבים. עם זאת, אנו מאמינים כי השימוש בAECII העכברי העיקרי מאפשר הבנה טובה יותר של התפקיד מסוג זה תא בתהליכים מורכבים כמו זיהום או דלקת אוטואימונית. AECII העכברי הראשי יכולה להיות מבודד באופן ישיר מבעלי חיים סובלים מתנאי נשימה כאלה, כלומר הם היו כפופים לכל הגורמים החיצוניים הנוספים ששחקו תפקיד בהגדרה נתחה. כדוגמה, AECII קיימא יכול להיות מבודד מעכברים נגועים intranasally עם שפעת וירוס, אשר בעיקר מטרות אלו תאים לשכפול 13. חשוב מכך, באמצעות זיהום vivo לשעבר של AECII המבודד מעכברים בריאים, מחקרים של תגובות התאיות רכובות על זיהום יכולים להיות רחוקים יותר מורחבים.
הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי העיקרי מתבסס על עיכול האנזימטית של ריאת העכבר ואחריו התיוג של השעית תא וכתוצאה עם נוגדנים ספציפיים לCD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 וCD16/CD32. AECII הגרעיני לאחר מכן זוהה כאוכלוסיית תא הפיזור ללא תווית וצידה הגבוה (SSC גבוה) ומופרד על ידי תא הפעיל פלואורסצנטי מיון 3.
בהשוואה לשיטות חלופיות של בידוד תאי האפיתל עיקריים מריאות עכבר, הפרוטוקול שלנו לבידוד cytometric זרימת AECII ידי בחירה שלילית פירוש לא נגע, בת קיימא והטהור ביותר AECII בזמן קצר יחסית. בנוסף, ובניגוד לשיטות מקובלות של בידוד על ידי צילום פנורמי ודלדול של לימפוציטים באמצעות קשירה של נוגדן בשילוב חרוזים מגנטיים 14, 15, מיון תא cytometric זרימה מאפשר אפליה באמצעות גודל תא וגרעיניות. בהתחשב בכך שהמכשור למיון תא זרימת cytometric זמין, ההליך המתואר ניתן ליישם בעלויות נמוכות יחסית. הבא לנוגדנים ואנזימים להתפוררות ריאות, ללא ריאגנטים נוספים כגון מגנטי רגיליםחרוזים נדרשים. התאים המבודדים מתאימים למגוון רחב של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים, הכוללים בתרבות מבחנה ומבחני גירוי תאי T, כמו גם transcriptome, Proteome או ניתוחי secretome 3, 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי על ידי הזרימה cytometry מציע דרך מהירה לגישה לתאים ראשוניים מריאת העכבר למגוון שלם של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים. ההליך המתואר תשואות אוכלוסיות קיימא והטהורות ביותר של AECII כי הם די במספר ניתוחים שלאחר מכן ישירות, כגון בידוד RNA (רא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למ Hoxter לקבלת סיוע טכני במיון AECII העכברי העיקרי בין 2 דגימות רמת biosafety.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר הגרמניה (DFG) לDB (SFB587, TP-B12 וBR2221/1-1) ומלגה מבית הספר למחקר ביו הנובר (DFG GSC 108) לרמה של AA. DB נתמך על ידי היוזמה של הנשיא וקרן רשת של הלמהולץ איגוד מרכזי מחקר הגרמני (HGF) תחת W2/W3-029 מספר החוזה.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
