Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио
Summary
Данио представляют собой мощную модель позвоночных, которые были недостаточно используемых для метаболических исследований. Здесь мы опишем быстрым способом измерения<em> В естественных условиях</em> Метаболический профиль развивающихся данио рерио, что позволяет сравнивать различные параметры митохондриальной функции между генетически или фармакологически манипулировать эмбрионами, увеличивая тем самым применимость данного организма.
Abstract
Все большее цели в области метаболизма, чтобы определить влияние генетики на различные аспекты функции митохондрий. Понимание этих отношений поможет понять этиологии для целого ряда заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией, такие как диабет и ожирение. Последние достижения в области приборостроения, позволило мониторинга различных параметров функции митохондрий в клеточных линиях или ткани эксплантов. Здесь мы представляем метод для быстрого и чувствительного анализа митохондриальной параметров функции в естественных условиях во время эмбрионального развития у рыбок данио помощью Seahorse биологических наук XF 24 внеклеточной анализатор потока. Этот протокол использует остров Capture микропланшеты, где один эмбрион помещается в каждую лунку, позволяя измерять биоэнергетики, в том числе: (i) базального дыхания; (II), базально митохондриального дыхания (III) митохондриального дыхания в связи с оборота АТФ; (IV) митохондриальной несвязанных дыхания или пр.отона утечки и (IV), максимальная дыхания. Используя этот подход эмбриональных параметров дыхания данио рерио могут быть сопоставлены между дикого типа и генетически измененных эмбрионов (мутант, ген избыточная экспрессия гена или нокдауна), или манипулируют фармакологически. Предполагается, что распространение этого протокола предоставит исследователям новые инструменты для анализа генетической основе метаболических нарушений в естественных условиях в данном соответствующие модели животных позвоночных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио рерио является устоявшейся генетической моделью для обоих вперед (ЕНУ мутагенеза) и обратный (пахоты, цинковый палец нуклеазы целевых нокаут, нокдаун морфолино) генетические подходы 3,4, в то время как функции генов у эмбрионов данио рерио также может быть легко заблокированы или активированный с использованием селективных фармакологических соединений, специфичных для закодированных продуктов. Благодаря своим внешним развитием и небольшой размер, эмбрионы рыбок данио являются особенно подходящими для метаболического анализа. Тем не менее, надежных измерений метаболического профиля и функции митохондрий в естественных условиях у эмбрионов данио рерио не было достигнуто, с одной лишь предварительное описание сообщил 5. Seahorse анализ был первоначально разработан для клеточных исследований метаболических и было продемонстрировано, чтобы дать точные и надежные результаты 6. Применение этой новой методологии эмбрионов данио рерио является значительным, и, вероятно, для усиления широкого использования этой модели для метаболических исследований.
В этом исследовании мы демонстрируем, измерение спектра параметры дыхания у эмбрионов данио рерио использование Seahorse Analyser, в том числе базальных дыхания, максимальная дыхания, дыхательный запасных мощностей, ATP оборота и утечки протонов. Мы также предоставляем пример того, как такие измерения могут быть соотнесены с другими физиологическими параметрами, в это накопление липидов случае, и использование фармакологических ингибиторов в этом анализе системы. В сочетании с использованием генетически измененных эмбрионов, это обеспечивает мощную экспериментальную платформу для понимания факторов, влияющих на обмен веществ.
Есть множество приложений для этой новой методологии, с митохондриальной дисфункцией замешан во многих человеческих болезней, таких как сахарный диабет 7, ожирение 8, 9 рассеянного склероза, болезни Паркинсона 10, болезнью Альцгеймера 11 и некоторых типов рака 12. Важно отметить, что оУра работы выполняются в естественных условиях, где все воздействия окружающей среды – таких как цитокины, связанных с развитием и т.д. роста – активны, тем самым обеспечивая физиологически соответствующего вида в естественных условиях дыхания и метаболический профиль. Как химические экраны также регулярно проводится в дикого типа и мутантных эмбрионов данио рерио фоне (рис. 1), роман фармацевтической, что влияние дыхание, митохондрии функцию и метаболизм могут быть легко определены с помощью Seahorse анализатора. Результаты создан с помощью Seahorse анализатор может быть использован в сочетании с другими анализы для предоставления дополнительной информации. Это может включать физиологического анализа, таких, как нефть-красные пятна, или молекулярного анализа, таких, как гибридизация для специфических маркеров адипоцитов, таких как cebpα, Pparα, PPAR-гамма, ФАС и т.д.
Там остаются некоторые ограничения в этой методологии. Хотя мы и другие были в состоянии использовать олигомицином для измеренияЮр производство АТФ и протонного утечки на молодых эмбрионов 5 (см. Рисунок 3), в эмбрионы старше 60 лет лечение HPF олигомицином неэффективно. Мы считаем, что в старых эмбрионов олигомицином не могут диффундировать так же легко, чем у более молодых эмбрионов делает результаты невозможно интерпретировать. С олигомицином результаты являются обязательными для определения дыхания из-за ATP оборота и несвязанных дыхание, мы в настоящее время исследуем более высоких концентрациях олигомицином пожилых эмбрионов. Тем не менее, антимицином лечения остаются в силе дольше, с другими измерениями, такими как базальные дыхания, максимальная дыхания и запасных дыхательной емкости, могут быть выполнены в старых эмбрионов данио рерио, до 68 HPF (не показано).
Еще одно ограничение в использовании текущие настройки анализатора Seahorse является физическое пространство внутри каждого островка пластина захвата, например, такие, что они пригодны только для эмбрионов данио рерио и молодых личинок. Таким образом, выполнение metabolIC исследований по диете вызванных ожирением у взрослых рыб, например, еще не технически возможно. Однако, это исследование может подтолкнуть развитие пластин, специально предназначенных для несовершеннолетних или взрослых рыб, тем самым расширяя сферу анализа возможных.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников фонда Университет Дикин данио рерио для обеспечения отличной постоянного ухода хозяйства. YG поддерживается Альфред Дикин стипендий аспирантов научных исследований и Центральной исследовательский грант от университета Дикин. SLM поддерживает NHMRC стипендий развития карьеры. ACW поддерживается NHMRC Включение Грант. Все авторы поддерживают Молекулярная и медицинских исследований Центра стратегических исследований при Университете Дикин.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer’s disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
