Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre
Summary
Poisson-zèbre constituent un modèle vertébré puissant qui a été sous-utilisée pour les études métaboliques. Nous décrivons ici un moyen rapide pour mesurer la<em> In vivo</em> Profil métabolique du poisson zèbre développement qui permet de comparer les différents paramètres de la fonction mitochondriale entre génétiquement ou pharmacologiquement embryons manipulés, ce qui augmente l'applicabilité de cet organisme.
Abstract
L'un des objectifs de plus en plus dans le domaine du métabolisme est de déterminer l'impact de la génétique sur les différents aspects de la fonction mitochondriale. La compréhension de ces relations aidera à comprendre l'étiologie sous-jacente à toute une gamme de maladies liées à un dysfonctionnement mitochondrial, comme le diabète et l'obésité. Les récents progrès dans l'instrumentation, a permis à la surveillance des paramètres distincts de la fonction mitochondriale dans des lignées cellulaires ou des explants de tissus. Nous présentons ici une méthode pour une analyse rapide et sensible des paramètres de la fonction mitochondriale in vivo au cours du développement embryonnaire du poisson zèbre en utilisant le Seahorse biosciences XF 24 analyseur de flux extracellulaire. Ce protocole utilise la capture Islet microplaques où un seul embryon est placé dans chaque puits, permettant la mesure de la bioénergétique, y compris: (i) la respiration de base, (ii) la respiration mitochondriale basale (iii) la respiration mitochondriale en raison de renouvellement de l'ATP, (iv) des mitochondries respiration découplée ou prOton fuite et de la respiration maximale (iv). En utilisant cette approche embryonnaires paramètres de la respiration du poisson zèbre peut être comparé entre le type sauvage et d'embryons génétiquement modifiés (mutants, la sur-expression du gène ou inactivation génique) ou les manipuler pharmacologiquement. Il est prévu que la diffusion de ce protocole permettra aux chercheurs de nouveaux outils pour analyser les bases génétiques des maladies métaboliques in vivo dans ce modèle animal vertébré pertinente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poisson zèbre est un modèle génétique bien établie à la fois vers l'avant (ENU mutagenèse) et arrière (Tilling, doigt de zinc nucléase ciblée knock-out, knock-down morpholino) 3,4 approches génétiques, tandis que la fonction des gènes dans les embryons de poisson zèbre peut également être facilement bloqué ou activé l'aide sélective de composés pharmacologiques spécifiques pour les produits codés. En raison de leur développement externe et de petite taille, embryons de poisson zèbre sont particulièrement adaptés à l'analyse métabolique. Cependant, la mesure robuste du profil métabolique et la fonction mitochondriale in vivo chez des embryons de poisson zèbre n'a pas été atteint, avec une seule description préliminaire rapportée 5. Analyse Seahorse a été conçu à l'origine pour les études métaboliques cellulaires et a été démontré pour donner des résultats précis et fiables 6. L'application de cette nouvelle méthode d'embryons de poisson zèbre est importante, et susceptible d'augmenter le plus large utilisation de ce modèle pour les études métaboliques.
Dans cette étude, nous démontrons la mesure de toute une gamme de paramètres de la respiration dans les embryons de poisson zèbre à l'aide de l'analyseur Seahorse, y compris la respiration basale, la respiration maximale, la capacité respiratoire de secours, renouvellement de l'ATP et la fuite de protons. Nous fournissons également un exemple de la façon dont ces mesures peuvent être mises en corrélation avec d'autres paramètres physiologiques, dans ce cas, l'accumulation de lipides et de l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de ce système de dosage. Combinée à l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés par les embryons, cela donne une puissante plate-forme expérimentale pour la compréhension des facteurs qui influent sur le métabolisme.
Il existe une variété d'applications pour cette nouvelle méthodologie, un dysfonctionnement mitochondrial est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, telles que le diabète sucré 7, l'obésité 8, la sclérose en plaques 9, la maladie de Parkinson 10, la maladie d'Alzheimer 11 et certains types de cancers 12. Surtout, our travail est effectuée in vivo, où les influences de l'environnement – tels que les cytokines, lié au développement de croissance etc – sont actifs, en fournissant ainsi une vue physiologiquement pertinente de la respiration et le profil métabolique in vivo. Comme les écrans chimiques sont aussi couramment effectuée dans le type sauvage et mutantes embryons de poisson zèbre fond (figure 1), les produits pharmaceutiques novateurs que la respiration influence, la fonction mitochondriale ou le métabolisme pourrait être facilement identifiés à l'aide de l'analyseur hippocampe. Les résultats obtenus en utilisant l'analyseur hippocampe pourrait être utilisée en conjonction avec d'autres dosages de fournir des informations supplémentaires. Cela peut inclure l'analyse physiologique, tels que l'huile rouge de coloration, ou l'analyse moléculaire, telles que l'hybridation in situ pour les marqueurs adipocytaires spécifiques tels que cebpα, PPARa, PPARy, etc SAF
Il reste quelques limites à cette méthode. Bien que nous et d'autres avons pu utiliser oligomycine à la mesureure la production d'ATP et de fuite de protons sur les embryons jeunes 5 (voir figure 3), dans des embryons de plus de 60 hpf oligomycine traitement est inefficace. Nous croyons que dans les anciens embryons oligomycine ne peut pas diffuser aussi facilement que chez les jeunes embryons rendant les résultats impossibles à interpréter. Comme les résultats oligomycine sont obligatoires pour la détermination de la respiration à cause de renouvellement de l'ATP et la respiration découplée, nous étudions actuellement des concentrations plus élevées de oligomycine pour les anciens embryons. Cependant, antimycine A traitements restent efficaces plus longtemps, avec d'autres mesures, telles que la respiration basale, la respiration maximale et la capacité respiratoire de secours, peut être effectuée dans embryons de poisson zèbre âgés, jusqu'à 68 hpf (non représentée).
Une autre limitation dans l'utilisation de la configuration actuelle Seahorse Analyser est l'espace physique au sein de chaque plaque de capture et d'îlots, de sorte qu'ils ne conviennent que pour les embryons de poisson zèbre et les jeunes larves. Par conséquent, l'exécution metabolic études sur le régime alimentaire induite par l'obésité chez les poissons adultes, par exemple, n'est pas encore techniquement possible. Cependant, cette étude pourrait inciter le développement des plaques spécialement conçues pour les poissons juvéniles et adultes, étendant ainsi la portée des analyses possibles.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les membres du personnel du Fonds pour l'Université de Deakin poisson zèbre pour fournir d'excellents soins d'élevage en cours. YG est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale Alfred Deakin et une subvention de recherche du Centre de l'Université Deakin. SLM est pris en charge par une bourse de développement de carrière NHMRC. ACW est soutenu par une subvention NHMRC d'habilitation. Tous les auteurs sont pris en charge par le Centre de recherche sur la recherche moléculaire et médicale à l'Université Deakin stratégique.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
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