Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석
Summary
신진 대사 연구 용 활용을 받아왔다 강력한 척추 모델을 대표 Zebrafish. 여기를 측정 할 수있는 빠른 방법을 설명<em> 생체 내</em따라서이 유기체의 적용을 증가 유전자 또는 pharmacologically 조작 배아의 차이 mitochondrial 기능 매개 변수의 비교를 허용 개발 zebrafish의> 대사 프로파일.
Abstract
신진 대사 분야의 성장 목표는 mitochondrial 기능의 다양한 측면에 대한 유전의 영향을 결정하는 것입니다. 이러한 관계를 이해하는 것은 이러한 당뇨병과 비만 등의 mitochondrial 장애와 연결되어 질병의 범위에 대한 기본 병인을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 장비의 최근 발전은 셀 라인 또는 조직 explants에서 mitochondrial 기능의 고유 한 매개 변수의 모니터링을 사용하고 있습니다. 여기 우리는 해마 bioscience XF 24 세포 플럭스 분석기를 사용하여 zebrafish 배아 발달 동안 생체 내 mitochondrial 기능 매개 변수의 신속하고 민감한 분석 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 작은 섬 캡처가 단일 배아 각 잘에 배치하는 위치를 bioenergetics의 측정을 허용, microplates 등의 활용 : 기초 호흡을은 (i), ATP 회전율로 인해 (II) 기초 mitochondrial 호흡 (III) mitochondrial 호흡을, (IV) mitochondrial uncoupled 호흡 또는 PRoton 누출 그리고 (iv) 최대 호흡. 이 방법 배아 zebrafish의 호흡 매개 변수를 사용하는 야생 유형과 유전자 조작 배아 (돌연변이, 유전자 이상 표현이나 유전자 최저) 또는 pharmacologically 조작 약자 사이에 비교할 수 있습니다. 은이 프로토콜의 보급이 관련 척추 동물 모델의 생체 내 대사 장애의 유전 기초를 분석하는 새로운 도구와 연구자를 제공 할 것입니다 것으로 예상된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
zebrafish 배아의 유전자 기능을 쉽게 차단하거나 활성화 할 수 있으며, Zebrafish는 앞으로 (ENU mutagenesis) 및 역방향 (Tilling, 아연 손가락 nuclease 대상 똑 아웃, morpholino의 최저) 유전자 접근 방법 3,4 모두에 잘 알려진 유전 모델입니다 인코딩 된 제품에 대한 특정 선택적 약리 물질을 사용합니다. 외부 개발 및 작은 크기로 인해, zebrafish의 배아는 신진 대사가 분석을 위해 특히 적합합니다. 그러나, 신진 대사 프로필과 zebrafish 배아의 생체 내 mitochondrial 기능의 강력한 측정 한 예비 설명과 함께, 달성 5보고되지 않았습니다. 해마 분석은 원래 셀 기반의 신진 대사 연구에 대한 설계 정확하고 신뢰할 수있는 결과에게 6주고 증명되었습니다. zebrafish 배아에 대한 새로운 방법론의 응용 프로그램은 중요한, 그리고 신진 대사 연구에 대해이 모델의 넓은 사용을 증가 할 가능성이 있습니다.
본 연구에서는, 우리는 기초 호흡, 최대 호흡, 예비 호흡기 용량, ATP의 매출과 양자 누설 등의 해마 분석기를 사용하여 zebrafish 배아에서 호흡 매개 변수의 범위의 측정을 보여줍니다. 우리는 또한 측정이 경우 지질 축적에,이 분석 시스템의 약리 억제제의 사용 등 생리적 매개 변수와 상관 할 수있는 방법의 예를 제공합니다. 유전자 – 변경된 배아의 사용과 함께,이 신진 대사에 영향을 미치는 요인을 이해하기위한 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다.
mitochondrial 장애 이러한 당뇨병 7, 비만 8, 다발성 경화증 9, 파킨슨 병 10, 알츠하이머 병 11, 암 (12)의 일부 유형으로 많은 인간의 질병에 연루되어있는이 새로운 방법론에 대한 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 중요한 것은, O이를 통해 생체 호흡과 신진 대사 프로필의 생리 학적 관련성이 높은 전망을 제공하는 활성 – 이러한 크린 시토 킨, 개발 관련 성장 등과 같은 – UR 작업은 모든 환경 영향은 생체에 수행됩니다. 화학 화면도 정기적으로 야생 유형 및 영향 호흡, 미토콘드리아 기능이나 신진 대사가 쉽게 해마 분석기를 사용하여 식별 할 수있는 돌연변이 배경 zebrafish의 배아 (그림 1), 소설 의약품에서 수행됩니다로서. 해마 분석기를 사용하여 생성 결과는 추가 정보를 제공하기 위해 다른 assays와 함께 사용할 수 있습니다. 여기에는 이러한 cebpα, Pparα 같은 특정 지방 세포 마커에 대한 현장 하이브리드 화에서와 같이 오일 – 레드 얼룩과 같은 생리 분석, 또는 분자 분석, Pparγ, FAS 등을 포함 할 수 있습니다
이 방법에 대한 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다. 우리와 다른 meas에 oligomycin를 이용할 수 있지만젊은 배아 60 hpf oligomycin 치료보다 오래된 배아 5 (그림 3 참조)에 우레 ATP 생산과 프로톤 누수가 비효율적입니다. 우리는 이전 배아에 oligomycin가 쉽게 해석 할 결과를 불가능하게 만들었 젊은 배아에 비해 확산 할 수 있다고 생각합니다. oligomycin 결과가 ATP의 매출과 uncoupled 호흡으로 인해 호흡의 결정에 대한 필수이기 때문에, 우리는 현재 이전 배아의 oligomycin 높은 농도를 조사하고 있습니다. 그러나, antimycin 치료는 기저 호흡, 최대 호흡 및 예비 호흡기 용량, 이전 zebrafish의 배아에서 수행 할 수 있습니다, 최대 68 hpf (미도시)과 같은 다른 측정과 함께 더 효과적 남아 있습니다.
현재 해마 분석기 설정을 사용하는 또 다른 제한들은 zebrafish 배아과 젊은 애벌레 만 적합되도록 잘 각각의 작은 섬 캡처 판에서 물리적 공간입니다. 따라서, metabol를 수행성인 생선의 다이어트 유발 비만에 IC 연구 예를 들어, 아직 기술적으로 적합하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 연구는이를 가능한 분석의 범위를 확장, 특히 청소년 또는 성인 생선을 위해 설계 판의 개발을하라는 메시지를 표시 할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 탁월한 진행 축산 서비스를 제공하는 Deakin 대학 Zebrafish 시설의 직원을 감사드립니다. YG는 알프레드 Deakin 박사 과정 이수 연구 활동과 Deakin 대학에서 중앙 연구 기금에 의해 지원됩니다. SLM은 NHMRC 경력 개발 친목에 의해 지원됩니다. ACW는 NHMRC 사용 권한 부여에 의해 지원됩니다. 모든 저자는 Deakin 대학에서 분자 및 의학 연구 전략 연구 센터에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
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