תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח
Summary
אימות תפוקה גבוהה של סמנים ביולוגיים מועמדים מרובים יכולה להתבצע על ידי ELISA הרציף במטרה למזער מחזורי הקפאה / פשרה ושימוש בדגימות פלזמה יקרות. הנה, אנחנו מדגימים איך לבצע רצף ELISAs במשך שישה סמני פלזמת תוקף שונים<sup> 1-3</sup> למחלת שתל נגד מארח (GVHD)<sup> 4</sup> באותו מדגם הפלזמה.
Abstract
אסטרטגיות proteomics גילוי משוחדות יש פוטנציאל לזהות מספר גדול של סמנים ביולוגיים חדשניים שיכול לשפר את בדיקות אבחון ופרוגנוזה בסביבה קלינית ועשויים לעזור התערבויות מדריך טיפוליות. כאשר מספר גדול של חלבוני מועמד מזוהה, זה עלול להיות קשה כדי לאמת סמנים ביולוגיים מועמדים באופנה בזמן ויעיל מדגימות מטופל פלזמה המונעות אירוע, נפח סופי ואין לו תחליף, כגון בתחילה חריף שתל נגד מחל מארח (GVHD), סיבוך מסכן חיים של השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT).
כאן אנו מתארים תהליך של ביצוע ELISAs הזמין מסחרי במשך שישה חלבונים GVHD תקף: IL-2Rα 5, TNFR1 6, 7 HGF, IL-8 8, elafin 2, וREG3α 3 (הידוע גם בPAP1), באופן רציף כדי למזער מחזורי הקפאת הפשרה, מופשר זמן פלזמה ושימוש בפלזמה. לביצוע הליך זה אנו מבצעים את ELISAs בסדר רציף, כפי שנקבעו על ידי גורם דילול מדגם כפי שנקבע במעבדה שלנו באמצעות ערכות ופרוטוקולי יצרן ELISA עם התאמות קלות כדי להקל על ביצועי ELISA רציפים אופטימליים. ריכוזי פלזמת הסמן הביולוגיים הנובעים אז ניתן להדר ונותחו לממצאים משמעותיים בתוך קבוצת מטופל. בעוד סמנים אלה הם כיום למטרות מחקר בלבד, שילובם בטיפול קליני כרגע נחקר בניסויים קליניים.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים.
Introduction
מחלה אקוטית שתל נגד מארח (GVHD), גורם מוביל לתמותה שאינה הישנות (NRM) לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT), נמדדת על ידי חוסר תפקוד בשלוש מערכות איברים: העור, בכבד ובמערכת עיכול (GI) מערכה 4. GVHD האקוטי מתרחש בדרך כלל בין שניים לשמונה שבועות לאחר השתלה, אך עלול להתרחש מאוחר יותר, ולעתים קרובות הוא קליני נבדל מסיבוכים שלאחר HSCT אחרים כגון רעילות מיזוג משטר, זיהום או תופעות לוואי של תרופות. באמצעות השימוש באסטרטגיות proteomic ואימות תפוקה גבוהה באמצעות ELISA הרציף, זיהו 6 חלבונים שריכוזים הם גבוהים בתחילת ביטויים קליניים של GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF ו IL-8, כאשר הוא משולב לתוך לוח 4-סמן ביולוגי יכול לאבחן GVHD בהופעת תסמינים קליניים ויכול לחזות הישרדות לאחר HSCT עצמאי של חומרת GVHD 1. Elafin, סמן ביולוגי לGVHD של skב, יכול להפלות בין הפריחה והפריחה GVHD מגורמים אחרים כגון התפרצויות סמים ויכול לחזות הישרדות השתלה 2. אנו זיהינו לאחרונה REG3α כמו סמן של GVHD של מערכת העיכול התחתונה, איבר המטרה הכי קשור NRM. ריכוז REG3α פלזמה אמין ניתן לזהות GVHD כסיבה לשלשולים לאחר HSCT ולתאם את החומרה היסטולוגית של GVHD בביופסיות מעי אבחון. ריכוזי REG3α בתחילת GVHD עיכול יכולים גם לחזות את ההיענות לטיפול וGVHD NRM 3. שילוב של הסמנים ביולוגיים GVHD האלה תקפים לטיפול קליני כעת נחקר בניסויים קליניים.
ניסויים אלה בוצעו על aliquots פלזמה הקטנה שנאסף מהחולים שקבלו HSCT בין שנתי 2000 ו 2010 בזמן הופעת GVHD שהם חסרי תחליף וכמות מוגבלת. בשל האופי היקר של דגימות אלה, פתחו נפגשהוד של מדידת ריכוזי חלבוני פלזמה מרובים בצורה יעילה, לשעתק לחסל מחזורים עודפים הקפאת הפשרה, בזמן הפשרה ושימוש בפלזמה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים. כתב יד זה מתמקד בהיבטים הטכנולוגיים של מדידת סמנים ביולוגיים GVHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת ELISA הרציפה מוצגת כאן מאפשרת מדידה של חלבוני פלזמה מרובות בנפחים קטנים של פלזמה שעשויה להיות קשה להשגה ו / או תחליף כגון דגימות מבני אדם עם מחל נדירות או דגימות פלזמה שהתקבלו בעכברי 9,10. את ELISAs הרציף מבוצעים בדרך כלל בצו של גורם דילול פלזמה גוברת, עם ELISAs דורש פלזמה מדוללת ≥ 1:10 בדרך כלל לא זקוק לשם תיקח, למרות שזה יכול להיעשות אם רוצה. היכולת לבצע ELISA סדרתית מוגבלת על ידי ערכות ELISA / פרוטוקולים שבפלזמה היא מעורבת עם חומרים כימיים אחרים או למאגרי שדילול שונים נדרשות לפלזמה, זה מונע ablility לדגימה מחדש להשתמש בשל חששות שאינם תואמים חיץ / מגיב יפריע לביצועים של בדיקה מסוימת. עם תכנון קפדני, 10 או יותר ELISAs יכול להיות מבוצע באותה דגימת פלזמה.
ent "> מעבדות בודדות הנדרשות להסתגל דילולי פלזמה על מנת שתהיינה תוצאות לפירוש המבוססות על ריכוזי פלזמה צפויות של החלבון של עניין בדגימות מהנבדקים. הבדלים בציוד מעבדה עלולה לגרום לצורך לייעל את הדגירה והתפתחות colorimetric פעמים, מספר הכביסות ו / או לשטוף לספוג פעמים על מנת לייעל את כל ELISA נתון.כדי להגדיל את כושר תפוקה גבוהה ודיוק ולבצע ניתוחים באופן יעיל וחסכוני, השימוש בפלטפורמה רובוטית טיפול נוזל מסוגלת לבצע ניתוחים על 384 גם צלחות ומכונת כביסת צלחת אוטומטית עם יחידה לערום מומלץ. ציוד זה יכול להגביר את הדיוק והדיוק של ניתוח שבוצע על ידי משתמשים מרובים, ויעזור לספק עקביות של ניתוח כדי להפחית ובין שונות התוך assay.
אנחנו השתמשנו ELISA הרציף על גבי פלטפורמות זמינות זמנית משתי סיבות: 1) רובזוגות נוגדנים לחלבונים חדשים לא יכולים בקלות להיות מצומדת בחרוזים או חומר אחר, כמו גם זמן רב ויקרים: 2) מבחני ELISA בודדים הם מדויקים יותר מאשר microarray זמנית או חרוזים, משני להעדר תגובה צולבת 11. אם שיטה אמינה הוא הוקם כדי לבצע microarrays multiplexed, חרוז מבוסס, זה עשוי להיות מסוגל להחליף את תהליך ELISA הרציף, אך הוא עשוי להיות מוגבל על ידי היכולת להטות את הנוגדנים לחרוזים ו / או במספר החלבונים הרצויים להיות מנותח.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי מענקי NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, הארטוול הקרן, וקרן הצדקה של דוריס הדיוק. ד"ר Paczesny הוא חוקר של אריק הארטוול הקרן ותכנית מחקר Manasevit Strelzer איימי.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
| Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
| Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
| Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
| Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
| Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
| Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
| 96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
| Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
| Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
| HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |
References
- Paczesny, S. A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood. 113, 273-278 (2009).
- Paczesny, S. Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin. Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).
- Ferrara, J. L. Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease. Blood. , (2011).
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. Graft-versus-host disease. Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Miyamoto, T. Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).
- Holler, E. Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation. Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).
- Okamoto, T. Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).
- Uguccioni, M. Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease. Blood. 81, 2252-2256 (1993).
- Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes. J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).
- Osuchowski, M. F., Remick, D. G. The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA. Methods. 38, 304-311 (2006).
- Schweitzer, B. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).
