急性移植片対宿主病のバイオマーカーの検証のためのハイスループットシーケンシャルELISA

1。実験0日目：IL-2Rα、REG3αとHGFの捕捉抗体とサンプルの調製およびELISAテストプレートコーティング分析される血漿アリコートサンプルを解凍し、プラズマからの上に底や脂質で血栓を分離するために10分間、12,000 rpmで遠心し、プルアップされます。未希釈血漿150μlをあらかじめ定義されたマップに従って手動ピペッティング（ソースプレート）を96ウェルV底プレートに各サンプルからメッキされます。アリコートをパラフィルムで包み、全体のプロセスの間に、4℃で湿潤チャンバー内に保持されます。もはやより72時間。 IL-2RαおよびHGFの捕捉抗体が再構成し、メーカーの仕様および50μl当たり希釈後、密封し、4℃で一晩インキュベートして、それぞれ96ウェル高結合ハーフウェルプレートの各ウェル℃にメッキされされますまた、多くのプレートを37℃で乾燥し、℃、後で使用するために、依存して4℃で保存することができますタンパク質の安定性にる。 REG3α捕捉抗体を密封し、4℃で一晩インキュベートし、384ウェルNuncマキシSORPプレートの各ウェル℃でめっきされるメーカーのコーティング緩衝液と25μlを用いて製造元のプロトコールに従って希釈化されることになります 2。実験1日目：IL-2RαELISA法（図1） IL-2Rαテストプレートを洗浄し、TBSでBLOTTOでブロックし、規格が再構成され、8点標準曲線は、メーカーのプロトコルごとに用意されています。 ブロッキング工程の後にプレートを洗浄後、希釈していない血漿50μLをELISA試験板にソースプレートから複製でメッキされており、各標準液50μlを二重にメッキが施されている。プレートを300rpmに設定したプレート回転子に密封し、室温で2時間インキュベートする。 プラズマは、IL-2RαELISA試験板から回収され、国連に戻されプラズマ源プレートを希釈した。 ELISAは、製造業者のプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 3。実験1日目：REG3αELISA法（図1） 未希釈血漿10μlを別のVボトムソースプレートに転送されます。メーカー提供の希釈緩衝液90μlを1:10希釈ソースプレートを作成するために、各ウェルに添加する。 REG3αELISAは、製造業者のプロトコルごとに実行されます（ボリュームで384ウェルプレート用に調整）、各ウェルの光学濃度を450から620 nmに設定プレートリーダーを使用して読み込まれ、データが保存され、分析されます。 4。実験1日目：捕獲抗体とエラフィンとTNFR1テストプレートコーティングエラフィンとTNFR1の捕捉抗体は、再構成およびDILになります製造元の仕様および50μl当たりutedを密封し、エラフィン室温で一晩インキュベートし、それぞれ96ウェル高結合ハーフウェルプレートの各ウェルに播種し、4°Cで一TNFR1のためでしょう。 5。実験日1-2：HGF ELISA法（図1） IL-2RαELISAを完了し、試験を確保した後に繰り返される必要はありません、無希釈血漿60μlのは、新しいソースプレートに転送し、その後、1×PBS中1％BSAの60μlを作るために各ウェルに添加し、 1：02希釈したプラズマ源プレート。 HGFの試験板は、洗浄後にTBSでBLOTTOでブロックし、規格が再構成されると8ポイントの検量線は、製造業者のプロトコルごとに用意されています。 ブロッキング工程の後にプレートを洗浄した後、1:2希釈した血漿50μLをELISA試験板上に二重にメッキが施されており、各標準液50μlを二重にメッキが施されている。プレートは密封され、300RPMでセットプレートローテーター上で室温で一晩インキュベートした。 1：02希釈した血漿は、HGF ELISA試験板から埋め立てと1:2希釈したプラズマ源プレートに戻される。 ELISAは、製造業者のプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 6。実験2日目：エラフィンELISA 未希釈血漿10μlを新しいソースプレートに転送され、その後1×PBS中1％BSAを190μLのは、プラズマdluted 1:20の200μlを作るために各ウェルに追加されます。 エラフィンELISAは、製造業者のプロトコル（ボリュームのハーフウェルプレート用に調整）に従って実施し、各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 7。実験ダY 2：TNFR1 ELISA PBS中1％BSAを含む25μlの1時25希釈した血漿125μlのを得るために、1:20のソースプレート（現在午前1時20分血漿100μlを含む）に追加されます。 TNFR1 ELISAは、製造業者のプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 8。実験2日目：IL-8 ELISA 1：02希釈した血漿60μlのは、新しいソースプレートに移しし、その後、IL-8希釈液180μlを、1:6希釈したプラズマ源プレートを作るために各ウェルに添加する。 IL-8 ELISAはメーカーのプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 すべてのELISAは、unuseを完了したあとDストック血漿を解凍アリコートに交換し、将来の使用のために凍結されます。