Эксплантов анализа для оценки сотовой поведение черепно Мезенхима

1. Подготовка ECM покрытием Посуда культуры или Покровные Подготовка ECM раствор путем растворения ECM субстрата в PBS (Дульбекко фосфатно-солевой буфер, Invitrogen, # 14040-133). Фильтр помощью шприца 0,2 мм фильтр (VWR, # 28145-495) и замораживание аликвоты при -80 ° C. Развести ECM раствор в PBS до нужной концентрации. Для MaxGel, развести в DMEM (Дульбекко изменения Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065). Если иммунофлюоресценции будет выполнена, стерилизовать 12 мм кругового покровные стекла (VWR, # 89015-724) путем погружения в этаноле и дайте высохнуть на воздухе. Это должно быть сделано в стерильном ламинарном. Если иммунофлюоресценции не будет выполнена перейдите к шагу 1.5. Место стерилизованные покровные в каждую лунку 24-луночный планшет (Corning, # 3526). Добавить 0,5 мл разведенного раствора субстрата в каждую лунку 24-луночный планшет и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов. Аспирируйте от решения ECM и мыть Автошоуе раз в PBS. Аспирируйте с PBS и использовать сразу или завернутые в парафильмом и хранили при 4 ° C в течение 2 недель. 2. Подготовка Dissection инструменты Sylgard пластин с добавлением древесного угля подготовлено в соответствии с протоколом производителя. Устойчивыми черном фоне этих плит обеспечивает поддержку сковав эмбриона и цвет обеспечивает хорошую контрастность, которая способствует визуализации полупрозрачных эмбриона. Для подготовки пластин весит непосредственно в три-влить стакан на весах 150 г Часть жидкого 15 г Части B и 1 г угольного порошка (инструменты Всемирного Precision, # SYLG184). Смешать с помощью деревянной палочки эскимо или шпателя. Налейте в стеклянную или пластиковую 100 блюд см. Используйте маленький факел бутана состоялось 10 до 12 дюймов выше блюда, чтобы сжечь любые пузыри. Место крышки на пластинках и пусть сидят в течение по крайней мере 24 часа в сутки, чтобы установить. Для подготовки рассечение инструментов вставки Minutien контактный (0,1 мм diameteг) в контактный держатель (Fine научных инструментов, # 26002-10 и № 26018-17, соответственно) в качестве альтернативы 26 калибровочных иглы (BD, # 309597) согнуты под прямым углом с помощью пинцета можно использовать в качестве рассекающих инструментов. Заостренный Студенческая Дюмон # 5 пинцет (Fine Инструменты наук, # 91150-20) с использованием точильный камень (Fine научных инструментов, # 29008-22). Стерилизовать всех рассечение инструментов с 70% этанола перед использованием. 3. Коллекция эмбрионов Усыпить приурочен беременных мышей в 8,5 coitum сообщению дней в зависимости от животного правил использования комитетов и удалить матку. Место матки в пластиковой чашке Петри стерильной PBS. Вымойте матки раза стерильной PBS. Под микроскопом рассечение осторожно удалить эмбрион от deciduas с помощью пары щипцов. Удалить внеэмбриональной мембраны и сохранить для генотипирования, если необходимо. Этап эмбриона путем подсчета сомитов. Идеальный этапы, чтобы сделать эксплантов для анализа сотовой БехAvior во время нейронные раза высота будет между 6 и 10 сомитов стадиях, когда нервные валики только начинают, чтобы поднять и перед главным морфогенеза черепа мезенхимы происходит. Вымойте эмбриона в PBS. Место в черной пластины Sylgard с DMEM, который не содержит фенола красного (Invitrogen, # 21063-029). Снимите внеэмбриональной мембраны и сохранить для генотипирования, если необходимо. 4. Подготовка Экспланты Refocus микроскопом на самом высоком увеличении над головой область зародыша. Сделайте разрезы с рассечения иглы в каждой руке. Использование одной иглы для хранения ткани на месте, а другой, чтобы сделать разрезы. Отрежьте голову эмбриона впереди ромбомеры. Разрежьте вдоль средней линии, чтобы разделить пополам голову на две равные половины. Вырезать вокруг внешних краях головы и средней линии. Эти сокращения удалить premigratory гребня и поверхности эктодермы на внешней границе ипрехордальной пластинки в средней линии. Остальные ткани будет эксплантов и будет содержать миграции черепно нервного гребня, параксиальной мезодермы и эктодермы поверхности. Как ткани вырезать, удалить мусор из расчлененных блюдо с помощью стерильной пипетки Пастера. Это позволяет избежать путаницы эксплантов с расчлененным мусора. Осторожно промыть эксплантов на пипетировать вверх и вниз с 20 мкл пипетки и Pipetman. Это позволит удалить слабо прикрепленные клетки и предотвратить неровными краями на эксплантов. Тщательно подобрать каждому эксплантов примерно 10 мкл жидкости, используя 20 мкл пипетки и Pipetman и место в центре покрытием культуру. Добавить 20 мкл культуральной среде, дополненной 15% FBS, чтобы покрыть эксплантов. Место пластины в увлажненной тканью культуры инкубаторе (5% CO 2, 37 ° C) в течение 1-2 часов, чтобы позволить эксплантов прикрепить к нижней части блюда. Просмотр периодически, чтобы гарантировать, что эксплантов не сушитиз. Когда эксплантов придает, осторожно добавить в каждую лунку по 250 мкл DMEM с добавлением 10% FBS, который был нагревают до 37 ° С на водяной бане. После эксплантов приложил они не будут двигаться, когда пластина осторожно встряхивают под микроскопом. Вернуться блюдо в культуре ткани инкубатора. После 24 часов, эксплантов будут прочно прикреплены и клетки начнут эмигрировать. В это время фармакологические препараты могут быть добавлены к средствам массовой информации. 48 ч после посева, клетки мигрировали из эксплантов. Расстояние миграции могут быть визуализированы и образ. Обычно мы остановить культуры в этот момент, так как эксплантов начинают проявлять признаки снижения жизнеспособности с более инкубации. Жизненно важные пятна, такие как акридинового оранжевого или синего трипанового также может быть использована для проверки жизнеспособности эксплантов. В этот момент изображение может быть приобретен к документу расстояние и количество клеток, которые мигрируют из эксплантов. Кроме того, если эксплантов высевали на покровные стекла,они могут быть установлены и иммуногистохимических анализов, чтобы визуализировать белки интерес. Критические шаги в протокол Вырезать эксплантов примерно такого же размера. Очистить все рассечение мусора с рассечения пластины, как вы рассечения, чтобы избежать запутанной мусора с желаемым эксплантированных ткани. Когда покрытие эксплантов в колодцах или на покровные убедитесь, что поместили каплю среды с эксплантов в центре хорошо. Разрешить эксплантов достаточно времени, чтобы прикрепить до наводнения также со средствами массовой информации. Лечение условия должны быть стандартизированы для каждой подложки и фармакологических тестов агента. Два эксплантов могут быть сделаны из каждого эмбриона (один слева и один справа от нервной трубки). При тестировании миграции клеток из мутантные линии мышей при различных экспериментальных условиях, положите один мутантный эксплантов в контрольной группе, а другая в группе, получавшей лечение. Поиск и устранение неисправностей Если эксплантов не в состоянии приложить, увеличить отведенное время для вложений. По нашему опыту, примерно половина из эксплантов не придают и больше эксплантов придерживаться более эффективно. Если эксплантов приложить к периферии хорошо они будет трудно изображения. Будьте уверены, чтобы разместить эксплантов в центре хорошо. В идеале эксплантов будет примерно такого же размера. Тем не менее, расхождения в размере эксплантов могут быть скорректированы для использования диаметр эксплантов в качестве поправочного коэффициента quanitating миграции клеток из эксплантов. Если заражение происходит обязательно стерильные условия труда используется. Все инструменты и рабочие поверхности должны быть стерилизованы с 70% этанола. Пипец и чашки Петри должно быть новым и стерильным. Если экспланты заблудиться во время вскрытия, периодически удалять мусор, чтобы не потерять эксплантов. Освоение рассечение занимает много времени и требует практики. Optiмал увеличение, острые инструменты диссекции и иглы помощь.