頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

1。 ECMコート培養皿またはカバーガラスの作製 PBS中のECM基板（ダルベッコの生理食塩水、インビトロジェン、＃14040から133をリン酸緩衝）を溶解させてECMのストック溶液を調製します。 -80℃で0.2ミリメートルシリンジフィルター（VWR、＃28145から495まで）、アリコートで凍結℃を使用してフィルタ PBS中で所望の濃度にECMの原液を希釈します。 MaxGelは、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地、インビトロジェン、＃11995から065）で希釈してください。 免疫が実行される場合には、エタノールに浸漬することにより、12ミリメートルの円形カバーガラス（VWR、＃89015から724まで）を殺菌し、空気乾燥することができます。これは、無菌層流フード内で行う必要があります。免疫を行わない場合には1.5に進みます。 24ウェルプレート（コーニング、＃3526）の各ウェルに滅菌カバースリップを置きます。 3時間室温で24ウェルプレートでインキュベートの各ウェルに希釈した基質溶液0.5mlを追加します。 ECMソリューションおよび洗浄THREを吸引PBS中でのe倍。 PBSを吸引し、すぐに使用するか、パラフィルムで包み、4℃で2週間まで保管。 2。解剖ツールの準備追加された木炭とシルガードプレートは、製造業者のプロトコルごとに用意されている。これらのプレートの抵抗力が黒の背景には、胚を押さえつけるためのサポートを提供し、色は半透明の胚を可視容易に良好なコントラストを提供しています。 プレートを準備するには残高150グラムパーツのトライ注ぐビーカー液体15グラムパートBと1グラムの炭粉（世界精密機器、＃SYLG184）に直接量る。木製のアイスキャンデーの棒または舌圧子を用いて一緒に混ぜる。ガラスまたはプラスチックの100 cmの皿に注ぎます。皿上約10〜12インチは、任意の気泡を焼き切るために開催された小さなブタントーチを使用しています。場所は、プレート上のふたおよび設定するには、少なくとも24時間放置します。 （0.1 mmのdiamete Minutienピンインサート解剖ツールを準備するにはr）のピンホルダー（ファイン科学ツール、＃26002から10と＃26018から17、それぞれ）に交互に26ゲージ針（BD、＃309597）は、鉗子を用いて直角に曲げ解剖楽器として使用することもできる。研ぎ石（ファイン科学ツール、＃29008から22）を使用して学生デュモン＃5鉗子（ファイン科学ツール、＃91150から20）を削った。 使用前に70％エタノールを用いてすべての解剖ツールを殺菌。 3。胚のコレクション動物使用委員会の規制に従って8.5日後coitumで時限妊娠マウスを安楽死させると子宮を取り除く。 滅菌PBSでプラスチックシャーレに入れ、子宮。 滅菌PBSで一度子宮を洗浄する。 解剖顕微鏡下で慎重にピンセットを使用してdeciduasから胚を削除します。 胚体外膜を取り外し、必要に応じてジェノタイピングのために保存。 体節を数えることによって段階の胚。携帯BEHを分析するために外植片を作るために理想的な段階ニューラル倍上昇時aviorは、神経ヒダがちょうど昇格し始めていると頭蓋の間葉の主要な形態形成が行われる前に6と10体節のステージの間になります。 PBS中で胚を洗浄します。全くフェノールレッド（インビトロジェン、＃21063から029まで）が含まれていませんDMEMで黒SYLGARDプレートに入れます。胚体外膜を取り外し、必要に応じてジェノタイピングのために保存。 4。外植片の作製胚の頭部の上、可能な限り最高の倍率で顕微鏡に再び焦点を合わせる。 それぞれの手で解剖針でカットを行う。切り傷を作るために一つの場所に組織を保持するために、針およびその他を使用しています。 rhombomeresへ前の胚の頭部を切り落とした。 2等分に頭を二分する正中線に沿って切り取ります。 頭と正中線の外側のフリンジの周りにカット。これらのカットは、外側の境界でpremigratoryクレストと表面外胚葉を削除します正中線で脊索前板。残りの組織は、外植片となり、移行頭部神経堤、沿軸中胚葉と表面外胚葉が含まれています。 組織が切断されたように、滅菌パスツールピペットを用いて皿から解剖ホコリを取り除きます。これは、解剖した破片で外植片を混乱させないようにします。 穏やかに20μlのピペットチップとピペットマンで上下ペッティングにより植を洗う。これは緩く付着した細胞を除去し、外植片にギザギザのエッジを防ぐことができます。 慎重によくコーティングされた文化の中心地で20μlのピペットチップとピペットマンと場所を使用して、液体の約10μlの各外植片を拾う。 外植片をカバーするために15％FBSを添加した培地20μlを追加します。 1〜2時間加湿組織培養インキュベーター（5％CO 2、37℃）に入れプレートは外植片は、皿の底に付着することを可能にする。外植片を乾燥しないようにするために定期的に表示外。 外植片が付着したときは、慎重に℃の水浴中で37度に暖めてある10％FBSを添加した各ウェルに250μlのDMEMに追加します。一度外植片は、プレートを穏やかに顕微鏡下で振られたとき、彼らは移動しません添付しました。 組織培養インキュベーターに皿を返します。 24時間後、外植片をしっかりと接続され、細胞が移住を開始します。この時点で薬理学的薬剤は、培地に添加することができます。 めっき後の48時間後、細胞を外植片から移行しているだろう。移行距離を可視化し、画像化することができる。外植片は長いインキュベーションと生存率低下の兆しを見せ始めて以来、私たちは通常、この時点で培養を停止します。例えば、アクリジンオレンジまたはトリパンブルーなどの生体染色はまた、外植片の生存を確認するために使用することができます。 この時点で画像が外植片からの移行細胞の距離や数を記録するために取得することができます。あるいは、外植片は、カバースリップ上に播種した場合、彼らは固定されており、免疫組織化学的分析は、目的のタンパク質を可視化するために行うことができる。 プロトコルの重要なステップほぼ同じサイズの外植片を切り取ります。 あなたが希望する外植組織に混乱破片を避けるために解剖される解剖板からすべての解剖破片をクリアします。 ウェル内またはカバースリップ上にめっき外植時は井戸の中心で外植片とメディアの滴を配置するようにしてください。 メディアでよく氾濫する前に取り付けるために十分な時間を植許す。 処理条件は、使用されるすべてのテスト用基板と薬剤のための標準化されるべきである。 二つの外植片は、各胚（左から1と神経管の右から1）で行うことができます。 異なる実験条件下で変異マウスラインからの細胞の遊走をテストする際には、処理されたグループ内の1つの変異体対照群における外植片と他のを入れた。 トラブルシューティング外植片は、接続に失敗した場合、添付ファイルに割り当てた時間を増やします。我々の経験では、外植片の約半分は、添付しないと大外植片は、より効率的に付着している。 外植片は、井戸の周囲に付着した場合、彼らは想像し難いでしょう。井戸の中心に植片を配置してください。 理想的には、外植片はほぼ同じサイズになります。しかし、外植片の大きさの不一致は、外植片からの細胞の移行をquanitating時補正係数として植片の直径を用いて補正することができる。 汚染が発生した場合は無菌の労働条件が使用されていることを確認してください。すべてのツールと​​作業面を70％エタノールで滅菌されるべきである。ピペット、ペトリ皿は新しいし、無菌でなければならない。 外植片は解剖中に失わ取得している場合は、定期的に外植片の紛失を防ぐには、ホコリを取り除きます。 マスタリング解離は時間がかかり、練習が必要です。オプティMAL倍率、鋭い解剖ツールと針のヘルプを参照してください。