Combler l'interface bio-électronique avec Biofabrication

1. Électrodéposition d'alginate Connecter une alimentation aux électrodes personnalisés fabriqués par des cordons de raccordement à l'aide des pinces crocodiles. Un oxyde d'étain indium (ITO) lame de verre recouverte agira en tant que l'anode (électrode de travail) et une feuille de platine servira en tant que cathode (contre-électrode). Positionner les électrodes afin que la surface d'ITO pour être fonctionnalisé est opposée à la contre-électrode et est positionné verticalement à être plongée dans une solution ou horizontalement de telle sorte que la solution de dépôt est contenue sur la surface. Préparer une solution d'alginate de dépôt en mélangeant alginate 1% et 0,5% de CaCO 3 (en poids) dans de l'eau distillée, puis autoclavage la solution. Il est recommandé de mettre en agitation continue de la solution lorsqu'il n'est pas utilisé. Submerger les deux électrodes dans la solution de dépôt. L'alginate peut être utilisé marqué par fluorescence avec FluoroSphères (Invitrogen), selon Cheng et al. 14, pour permettre fluorescenCE imagerie du film résultant. Appliquer une densité de courant constante (3 A / m 2) pendant 2 minutes, la tension se déplacera dans la plage de 2-3 V. Déconnecter l'électrode et retirer la solution non-déposé. Rincer délicatement le film avec NaCl (0,145 M) de supprimer l'alginate de superflu. Incuber brièvement film (~ 1 min) dans le CaCl 2 (0,1 M) pour renforcer le gel. Rincer avec de NaCl (0,145 M) et incuber dans une solution souhaitée complété avec du CaCl 2 (1 mM). Image en utilisant un microscope à fluorescence (figure 1B). 2. Codépôt des populations de cellules communicantes dans de l'alginate Une culture de signal de cellule-expéditeur (W3110 poids E. coli), cultivés dans des milieux LB, et une culture de cellules de signal-récepteur (MDAI2 + pCT6-LSRR – amp r + pET-DsRed – kan r), cultivés dans des milieux LB + 50 pg / ml de kanamycine et chaque ampicilline, doit être grandi en une nuit unee re-inoculé pour la croissance d'une densité optique (moins de 600 nm) de 1. Ajuster la densité optique de la culture cellulaire récepteur pour 0,4 à 0,6 avec LB avant utilisation. Préparer une solution de dépôt de l'alginate de 2% et 1% de CaCO 3, et mélanger avec chaque culture cellulaire dans un rapport 1:1 à une concentration finale de l'alginate de 1%, 0,5% de CaCO 3, avec les cellules dilué à une densité d'environ la moitié la densité de culture. Utilisez une lame de verre à motifs avec des électrodes d'ITO deux contenus par un polydiméthylsiloxane (PDMS) bien (préparé selon les instructions Sylgard et couper à la taille désirée) et une contre-électrode de platine. Connectez une électrode ITO à une alimentation électrique avec le platine, comme décrit dans la procédure 1 (électrodéposition alginate). Immerger les électrodes dans une solution de dépôt contenant des cellules réceptrices. Définir l'alimentation d'un courant constant à une densité de 3 A / m 2, où la dimension surface est définie par l'électrode unique sur lequel deposition va se produire. Appliquer le courant pendant 2 minutes afin de permettre codéposition des cellules dans la matrice d'alginate. Rincer le film tel que décrit à l'étape 1.5. Commuter la connexion anodique à la seconde, adjacente, électrode en ITO. Répétez la procédure de dépôt (Étapes 2.4 – 2.7), mais cette fois l'introduction de la solution contenant les cellules expéditeur. Incuber la puce à 2 électrodes contenant des cellules codéposés et de calcium d'alginate-nuit à 37 ° C dans un tampon phosphate salin (PBS) additionné de milieu LB 10% et 1 mM CaCl 2. Après incubation, l'image en utilisant un microscope à fluorescence (figure 2B). 3. Électrodéposition Chitosan Branchez l'alimentation aux électrodes par l'intermédiaire des pinces crocodiles. Une puce de silicium revêtu d'or agira en tant que cathode (électrode de travail) et une feuille de platine servira l'anode (contre-électrode). Position de la surface de l'électrode d'or de sorte èmequ'il s'oppose à la contre-électrode et les deux sont positionnés verticalement à être plongée dans une solution ou horizontalement de telle sorte que la solution de dépôt est contenue sur la surface. Préparer une solution de chitosane en mélangeant paillettes chitosane dans de l'eau et en ajoutant lentement HCl 2 M pour dissoudre les polysaccharides (pH final 5,6), en veillant à suivre la procédure décrite par Meyer et al. 15. Placer les électrodes dans une solution de chitosane (0,8%), complètement submergés la zone souhaitée pour le dépôt. Le utilisé chitosane peut être marqué de manière fluorescente avec la 5 – (et-6)-carboxyrhodamine 6G ester succinimidylique (Invitrogen), selon Wu et autres 8, à l'image du film électrodéposé par microscopie de fluorescence.. Appliquer une densité de courant constante (4 A / m 2) pendant 2 minutes. Tension se déplacera dans la plage de 2-3 V. Calculer la densité de courant en fonction de la surface d'or de l'électrode de travail exposée à la depositiosolution n. Rincer l'électrode avec de l'eau DI pour enlever superflue chitosane. La puce peut être stockée dans l'eau ou du PBS (10 mM, pH 7,0). Image en utilisant un microscope à fluorescence (figure 3C). 4. Transduction électrochimique avec un film fonctionnalisé Chitosan Codépôt chitosane et de glucose-oxydase (GOx) à partir d'une solution (1% de chitosane, 680 U / ml GOx, pH 5,6) à une densité de courant de 4 A / m 2 sur une électrode à motifs selon l'une procédure 3 (électrodéposition chitosane). Un film de chitosane piégé dans GOx sera généré. Montage de l'électrode traitée à un système à trois électrodes de l'électrode de travail, un fil de platine en tant que contre-électrode et Ag / AgCl que l'électrode de référence, tel que décrit à la Figure 4A. Plonger les électrodes dans une solution tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) contenant du NaCl (0,1 M). Électrochimiquement conjugué à la protéine du chitosaneFilm en appliquant une tension constante (0,9 V) pendant 60 à l'aide chronoampérométrie 10. Placez la puce dans un tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) et laver pendant 10 minutes sur un agitateur orbital pour éliminer toute GOx qui n'a pas réagi de NaCl et non conjuguée. Remettre en place le système à trois électrodes tel que décrit dans l'étape 4.2 et plongez dans une solution de 5 mM de glucose. Utilisation de voltammétrie cyclique, de balayer le potentiel dans un sens positif à 0,7 V. Utilisez un film de contrôle ne contenant pas de glucose-oxydase comme une comparaison de la quantité d'oxydation vu dans le balayage (figure 4B). Retirer les électrodes de la solution de glucose et rincer avec un tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) puis placer les électrodes dans un bécher de 10 ml contenant 8 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0). La puce de polarisation GOx-fonctionnalisé à 0,6 V pour servir comme électrode de travail (figure 4C). Ajouter aliquotes de glucose dans le tampon (chaque aliquote augmente la concentration en glucose par4 mM). Générer une courbe standard entre le courant l'état d'équilibre et la concentration de glucose pour le film GOx-fonctionnalisé chitosane. 5. Fonctionnalisation de protéines Utilisation de l'assemblage enzymatique Utilisez une lame de verre à motifs avec une médaille d'or à côté et l'électrode ITO contenue dans un puits PDMS. Biais de l'électrode en or avec un potentiel cathodique par électrolyse au chitosane comme indiqué précédemment. Rincer le film brièvement dans de l'eau DI, puis du PBS à la pipette. Ajouter une solution de 3 uM bleus marqués par fluorescence "AI-2 Synthase" 16 (en utilisant un kit de marquage DyLight) + 100 U / ml dans du PBS tyrosinase. Incuber pendant 1 h à température ambiante, puis rincer le film avec du PBS. Appliquer un potentiel anodique à l'électrode en ITO de codéposer une solution de dépôt d'alginate contenant des cellules de réception (tel que préparé dans les étapes 2.1-2.2). Suivez les étapes de procédure 2.3-2.6 2 (Codépôt des populations de cellules dans l'alginate). Pour générerle signal transmis (AI-2) par voie enzymatique, après rinçage des films ajouter une solution de 500 uM S-adénosyl homocystéine (SAH) dans du PBS, complétée par LB 10% des médias et 1 mM CaCl 2. Couvrir les électrodes pour éviter l'évaporation de la solution et incuber pendant une nuit à 37 ° C. Cela permettra d'une réponse cellulaire du récepteur en générant une protéine fluorescente rouge (DsRed). Des électrodes adjacentes peut être imagée par microscopie de fluorescence en ajustant les filtres pour capter la fluorescence bleue du synthase IA-2 et de la fluorescence rouge exprimé par la cellule réceptrice codéposés (figure 5B). 6. Les résultats représentatifs Imposées signaux électriques peuvent créer des micro-environnements localisées (par exemple, des champs et des gradients) à proximité d'une surface d'électrode et ces stimuli peut déclencher l'auto-assemblage des polysaccharides tels que l'alginate et le chitosane à déposer un film d'hydrogel sur la surface d'électrode. Parce que tson transition sol-gel a lieu à la surface d'électrode, le film résultant est electroaddressed, avec sa géométrie correspondant au motif d'électrode (1B figures, 3C). Films biocompatibles tels que l'alginate et de chitosane fournir des surfaces qui peuvent être fonctionnalisés avec des composants biologiques. Utilisation de l'alginate, des populations de cellules uniques ont été codéposé à des adresses distinctes. Preuve de leur electroaddressment sont observés lors de l'interaction entre l'expéditeur et le récepteur population de cellules. La molécule autoinducteur-2 (IA-2) diffuse à partir des cellules d'expéditeur et est absorbé par les cellules réceptrices, entraînant l'expression de la protéine fluorescente rouge DsRed (figure 2A). Dans la figure 2B, la fluorescence rouge est observée uniquement à l'électrode où les récepteurs sont adressées. Les groupes amine présents sur le chitosane lui fournir la réactivité du pH nécessaire pour électrodéposition ainsi que d'une surface appropriée pour une fonctionnalisation. Nousutilisé ces propriétés uniques par voie électrochimique conjuguer le oxydase de glucose biodétection (GOx) à électrodéposé chitosane films. Cette enzyme présente ensuite la capacité de détection de glucose par le biais d'une réaction enzymatique (figure 4A) production de peroxyde d'hydrogène qui peut ensuite être oxydé électrochimiquement pour produire un courant de sortie. De cette manière, un signal chimique peut être transduit à la figure électrique. 4B montre que les films dans lesquels GOx est électrochimiquement conjugué produire un signal de forte anodique en présence de glucose par rapport à ces films contenant pas GOx. Ces résultats indiquent GOx peut être monté sur un film déposé le chitosane et peut conserver son activité catalytique. En outre, figure 4C représente une étape augmentation de courant anodique produit en réponse à l'augmentation des concentrations de glucose. La courbe standard également présent dans la figure 4C montre que les augmentations des beaux-procédé dans un fas quasi linéaireHion dépend de la quantité de glucose ajouté. Ces résultats montrent que l'enzyme conserve également sa sensibilité à l'augmentation des concentrations de glucose sur la conjugaison du film chitosane. La limite inférieure de détection n'a pas été étudié ici comme il a déjà été caractérisé pour ce système dans l'œuvre de Meyer et al. Al. On a également ont montré l'immobilisation covalente d'une enzyme d'intérêt, de manière à contenir une personnalisé penta-tyrosine étiquette, sur le chitosane de façon enzymatique contrôlée. Plus précisément, ce processus est médié par l'enzyme tyrosinase. Comme le montre par le régime sur la figure 5A (supérieure), une enzyme, AI-2 synthase comprend une balise penta-tyrosine. Tyrosinase agit sur ​​l'étiquette la tyrosine, l'oxydation des groupes les résidus des phénols à O-quinones, qui a ensuite covalente se lient à des amines de chitosane de. Preuve de fonctionnalisation du film chitosane avec la synthase AI-2 par la tyrosinase assemblage est observé dans la figure 5B </strong>, où la Synthase AI-2 a été marqué par fluorescence bleue. Parce IA-2 synthase génère IA-2 à partir du substrat S-adénosyl homocystéine (SAH) de la même manière que les cellules expéditeur, la proximité de cellules réceptrices codéposés en présence d'SEP provoque également les cellules réceptrices à fluorescence réagir en exprimant DsRed (figure 5A (inférieure)). Fluorescence rouge des cellules réceptrices (Figure 5B) montre à nouveau une interaction entre les adresses en raison de la diffusion de l'IA-2 de l'un à l'autre, et indique en outre que les enzymes immobilisées au chitosane conservent l'activité d'une fois lié de manière covalente. Figure électrodéposition alginate 1.. (A) électrodéposition d'alginate de Mécanisme: Comme une électrode est polarisée anodiquement, électrolyse de l'eau se produit à sa surface, générant un pH localisée de faible. Des particules de carbonate de calcium réagir avec l'excédentde protons, libérant cations calcium que les particules se dissolvent. En présence de chaînes polymères d'alginate, les ions deviennent chélaté dans une "eggbox" réseau, formant un hydrogel réticulé à l'électrode. Comme la distance entre les électrodes augmente, l'alginate a une plus grande tendance à rester en solution en raison de la présence réduite des ions calcium. (B) Une forme de L ITO à motifs d'électrode a été utilisé à l'alginate de dépôt électrolytique. Un puits a été PDMS fixé à l'électrode de contenir un alginate vert marquage fluorescent (1%) et CaCO 3 (0,5%) solution de dépôt. Après électrodéposition pendant 2 min. une densité de courant de 3 A / m 2, l'hydrogel a été alginate electroaddressed imagée par microscopie de fluorescence. Figure 2. Codépôt des populations de cellules. L'interaction Scheme (A) montrant entre deux E. Les souches de E.: Une population produit autoinducteur-2 (AI-2), Une molécule de signalisation, et est appelé "AI-2 expéditeur." L'autre population, appelée «AI-2 du récepteur," est un journaliste de l'IA-2; lors de la réception de l'IA-2 par la diffusion de l'expéditeur, il exprime la protéine fluorescente rouge DsRed. (B) image de fluorescence rouge de la paire d'électrodes avec la population AI-2 expéditeur codéposé avec de l'alginate sur l'électrode gauche et AI-2 de la population récepteur codéposé avec de l'alginate sur l'électrode droite. La vue agrandie montre l'expression de la DsRed seuls les récepteurs AI-2. Figure 3. Électrodéposition Chitosan. (A) Schéma montrant l'électrodéposition pH-dépendante de chitosane. Électrolyse de l'eau à une électrode cathodique polarisée provoque un pH élevé localisée (représenté par un changement de couleur localisée d'un colorant indicateur de pH près de la cathode sur la photographie) qui stimule la transition sol-gel de chitosane dans cette région. (B) Les amines présentes sur le chitosane donner it pH-sensibles propriétés. Un pH supérieur à 6,3 (pKa de chitosane) les amines sont déprotoné, facilitant le passage de sa forme protonée soluble dans sa forme de gel insoluble. (C) une électrode en or à motifs a été utilisé pour dépôt électrolytique chitosane. L'électrode, reliée à la cathode à l'alimentation électrique, a été immergé dans une verte à marquage fluorescent chitosane (0,8%) solution de dépôt. Après électrodéposition pendant 2 min. une densité de courant de 4 A / m 2, le film electroaddressed chitosane a été imagé par microscopie de fluorescence. Figure 4. Transduction électrochimique d'un film fonctionnalisé chitosane. (A) Schéma montrant la mise en place d'un système à trois électrodes. Fonctionnalisé film de chitosane sert comme électrode de travail, un fil de platine en tant que contre-électrode et Ag / AgCl que l'électrode de référence. Transduction électrochimique du produit du glucose à travers ee réactions enzymatiques et électrochimique indiquées lorsque le peroxyde d'hydrogène produit peut être oxydé et détecté à l'électrode de travail. (B) cyclique voltammagram (CV) à l'électrode par un film de chitosan contenant la glucose-oxydase électrochimiquement conjugué (GOx) montre un signal fort anodique dans une solution de glucose à 5 mM. Un film ne contenant pas de GOx a servi de témoin et affiché aucun signal dans la même solution. (C) une courbe standard entre le courant anodique et la concentration de glucose présente une relation linéaire à proximité de (a augmenté chaque aliquote la concentration en glucose de 4 mM et également augmenté l'amplitude du courant dans le graphe encart d'une manière par étapes). Figure 5. Fonctionnalisation des protéines à l'aide de montage enzymatique. (A, supérieure) Schéma montrant la tyrosine-étiqueté "AI-2 synthase» étant covalente attaché à un film de chitosan par l'assemblée tyrosinase. Les résidus de tyrosine devenir OxidIzed à O-quinones par l'action de la tyrosinase et peut réagir avec les groupes amine sur le film de chitosan, la formation d'une liaison covalente. (A, inférieure) Le Synthase AI-2 génère AI-2 à partir d'un substrat (SAH), les cellules réceptrices de la signaler généré AI-2 par l'expression de fluorescence DsRed. (B) images de fluorescence montrant un film chitosane sur l'or, fonctionnalisé avec bleu marqué AI-2 synthase. Côte à côte, AI-2 cellules réceptrices sont codéposés avec de l'alginate d'ITO. Après addition du substrat enzymatique pour le bien et l'incubation, les cellules réceptrices AI-2 Express DsRed.