Преодоление Био-Электронный интерфейс с Biofabrication

1. Альгинат Электроосаждение Подключите блок питания к пользовательским сфабриковано электродов через патч-корды использованием крокодил. Оксид индия и олова (ITO), покрытых стекло будет действовать в качестве анода (рабочий электрод) и платиновой фольги будет служить в качестве катода (контр-электрод). Расположите электроды таким образом, поверхность ITO быть функциональными против счетчик электрода и позиционируется как вертикально погружается в раствор или горизонтально, что отложение решения, содержащиеся на поверхности. Подготовить решение альгинат осаждения путем смешивания 1% альгината и 0,5% CaCO 3 (по весу) в дистиллированной воде, а затем автоклавирования решения. Рекомендуется постоянно перемешивать раствор, когда он не используется. Погрузитесь в обоих электродах осаждения раствора. Альгинат может быть использован флуоресцентно меченные флуоросфер (Invitrogen), в соответствии с Cheng и соавт. 14, для обеспечения fluorescenсе визуализации полученной пленки. Применение постоянного тока (3 / м 2) в течение 2 минут, напряжение перейдет в пределах 2-3 В. Отсоедините электроды и удалить без хранение решение. Аккуратно промойте пленку с NaCl (0,145 м), чтобы удалить лишние альгината. Инкубируйте фильме кратко (~ 1 мин) в CaCl 2 (0,1 М) в целях укрепления геля. Полоскание с NaCl (0,145 М) и инкубировать в искомое решение дополнить CaCl 2 (1 мм). Изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 1б). 2. Соосаждения Общение клеточных популяций альгинат Сигнал отправителя культуре клеток (W3110 вес E.coli), выращенных в LB средствах массовой информации, и сигнал приемника культуре клеток (MDAI2 + pCT6-LSRR – усилитель г + ПЭТ-DsRed – кан г), выращенных в средствах массовой информации LB + 50 мкг / мл каждого из канамицин и ампициллин, должны быть выращены на ночья повторно привиты для роста оптической плотности (600 нм) 1. Настройка оптической плотности культуры клеток приемника 0,4-0,6 с LB перед использованием. Подготовить осаждения 2% раствора альгината и 1% CaCO 3, и смешать с каждой культуре клеток в соотношении 1:1 до конечной концентрации 1% альгината, 0,5% CaCO 3, с клетками разводят до плотности около половины культивирования плотность. Используйте стекло с узором двумя электродами ITO содержится полидиметилсилоксана (PDMS) и (подготовлен в соответствии с инструкциями Sylgard и сократить до нужного размера) и платиновый электрод счетчика. Подключите один ITO электродов к источнику питания с платиной, как описано в процедуре 1 (альгинат электроосаждения). Погрузите электроды в осаждения раствора, содержащего приемник клеток. Установите блок питания постоянного тока при плотности 3 / м 2, где размер площади определяется один электрод, на котором depositioя не произойдет. Применить текущие в течение 2 минут, чтобы обеспечить соосаждения клеток в матрице альгината. Промойте фильм, как описано в шаге 1.5. Включите анодной связи на второй, соседний, ITO электродов. Повторите процедуру отложения (шаги 2.4 – 2.7), но на этот раз введение раствора, содержащего отправителя клеток. Инкубировать 2-электрод чип содержащие codeposited клеток и кальция альгинат ночи при 37 ° C в фосфатном буферном растворе (PBS) с добавлением 10% LB СМИ и 1 мМ CaCl 2. После инкубации изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 2В). 3. Хитозан Электроосаждение Подключите блок питания к электродам через крокодил. Золото покрытием кремниевый чип будет выступать в качестве катода (рабочий электрод) и платиновой фольги будет служить в качестве анода (контр-электрод). Установите поверхности золотого электрода, таким йна него против счетчик электрода и как расположены вертикально, чтобы быть погружают в раствор или горизонтально, что отложение решения, содержащиеся на поверхности. Приготовьте раствор хитозана путем смешивания хитозана хлопья в воду и медленно добавляя 2 М HCl для растворения полисахаридов (окончательное рН 5,6), убедившись, что следовать процедуре, описанной Мейером и соавт. 15. Установите электроды в раствор хитозана (0,8%), полностью погружая нужную область для нанесения. Хитозан используемых можно флуоресцентно меченных с 5 – (а-6)-carboxyrhodamine 6G сукцинимидил эфира (Invitrogen), а на Ву и др. 8, изображение электроосажденных фильм флуоресцентной микроскопии.. Применение постоянного тока (4 / м 2) в течение 2 минут. Напряжение будет смещаться в пределах 2-3 В. Расчет плотности тока в зависимости от золотой поверхности рабочего электрода подвергаются depositioл раствора. Промойте электрод деионизированной водой, чтобы удалить лишние хитозана. Чип может быть сохранен в воде или PBS (10 мМ, рН 7,0). Изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 3). 4. Электрохимический трансдукция с функционализированных фильм Хитозан Codeposit хитозана и глюкозооксидазы (GOX) из раствора (1% хитозана, 680 ед / мл GOX, рН 5,6) при плотности тока 4 А / м 2 на узорной электрода в соответствии с процедурой 3 (Хитозан электроосаждения). Фильм хитозана в ловушке GOX будет. Прикрепите лечение электрода трех электродной системы в качестве рабочего электрода, платиновой проволоки в качестве контр-электрода и Ag / AgCl в качестве электрода, как показано на рис 4А. Погрузите электроды в раствор фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0), содержащем NaCl (0,1 М). Электрохимически сопряженных белка хитозанаФильм, применяя постоянное напряжение (0,9 В) для использования 60-х годов chronoamperometry 10. Поместите фишки в фосфатный буфер (0,1 М, рН 7,0), а также мыть в течение 10 минут на орбитальный шейкер для удаления непрореагировавшего NaCl и неконъюгированного GOX. Повторно приложить к трех-электродной системы, как описано в пункте 4.2 и погружают в раствор 5 мМ глюкозы. Использование циклической вольтамперометрии, подметать потенциала в положительном направлении до 0,7 В. Использование контроль фильм, не содержащий глюкозооксидазы для сравнения на сумму окисления видно развертки (рис. 4В). Удалите электроды из раствора глюкозы и промыть фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0), а затем поместить электроды в 10 мл стакан, содержащий 8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0). Смещение GOX-функциональными чипа до 0,6 V в качестве рабочего электрода (рис. 4С). Добавить порции глюкозы в буфер (каждую аликвоту повышает концентрацию глюкозы на4 мм). Создание стандартной кривой между устойчивым состоянием и концентрации глюкозы в GOX-функциональными фильм хитозана. 5. Белки Функционализация помощью ферментативного Ассамблеи Используйте стекло с узором золота и смежных ITO электродов, содержащихся в так PDMS. Смещение золотого электрода с катодным потенциалом электролитическое хитозана как было показано ранее. Промыть фильма кратко DI водой, а затем PBS помощью пипетки. Добавить раствор 3 мкм синий флуоресцентно с надписью "АИ-2-синтазы" 16 (с использованием DyLight комплект этикеток) + 100 ЕД / мл тирозиназы в PBS. Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре, затем смыть пленку с PBS. Применить анодного потенциала на электрод ITO в codeposit решение альгинат осаждения содержащие приемник клеток (подготовленный с шагом 2.1-2.2). Выполните шаги 2.3-2.6 процедуры 2 (соосаждения клеточных популяций в альгинат). Для созданияпередаваемого сигнала (АИ-2) ферментативно после промывки фильмы добавить раствор 500 мкМ S-аденозил гомоцистеина (САК) в PBS, с добавлением 10% LB СМИ и 1 мМ CaCl 2. Накройте электроды для предотвращения испарения раствора и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C. Это позволит клеточного ответа приемник, создавая красный флуоресцентный белок (DsRed). Прилегающие электроды могут быть отображены с флуоресцентной микроскопии, настраивая фильтры, чтобы захватить голубой флуоресценции АИ-2-синтазы и красной флуоресценции выраженные codeposited приемник клеток (рис. 5В). 6. Представитель Результаты Налагаемого электрических сигналов могут создавать локализованные микросреды (например, полей и градиентов) вблизи поверхности электрода, и эти стимулы могут вызвать самосборки полисахариды, такие как альгината и хитозана внести в гидрогель пленки на поверхности электрода. Поскольку тего золь-гель-переход происходит на поверхности электрода, в результате фильм electroaddressed, с его геометрией соответствующий шаблон электрод (рис. 1В, 3C). Биосовместимых таких фильмах, как альгината и хитозана обеспечивают поверхностей, которые могут быть функциональными с биологическими компонентами. Использование альгината, уникальные клеточные популяции были codeposited на отдельных адресов. Доказательства их electroaddressment наблюдается при взаимодействии между отправителем и приемником населения клетке. Молекула аутоиндуктор-2 (АИ-2) диффундирует от отправителя клеток и поглощается приемником клеток, что приводит к выражению DsRed красный флуоресцентный белок (рис. 2A). На рисунке 2B, красная флуоресценция наблюдается только на электроде, где приемники рассматриваются. Аминогрупп хитозана присутствует на обеспечить ее рН реакции, необходимые для электроосаждения, а также поверхность, подходящую для функционализации. Мыиспользовать эти уникальные свойства электрохимически сопряжения биодатчиков фермента глюкозо-оксидаза (GOX) для электролитического хитозана фильмов. Этот фермент затем предоставляет возможность для определения глюкозы через ферментативной реакции (рис. 4а) производит пероксид водорода, который затем может быть электрохимически окисляется до получения выходного тока. Таким образом, химический сигнал может быть трансдуцированных к электрическим. Рисунок 4B показывает, что фильмы, в которых GOX было электрохимически сопряженные производства анодной сильный сигнал в присутствии глюкозы в отличие от тех фильмов, не содержащих GOX. Эти результаты показывают, GOX могут быть собраны на хранение фильм хитозана и сохраняет каталитическую активность. Кроме того, рисунок 4C показывает, шаг увеличения анодного тока, в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови. Калибровочной кривой также присутствует на рисунке 4C показывает, что шаг увеличения проходили в ближайшее линейного ФАСХион зависит от количества глюкозы добавил. Эти результаты показывают, что фермент также сохраняет свою чувствительность к повышению концентрации глюкозы на сопряжении к фильму хитозана. Нижний предел обнаружения не изучалось здесь, как это ранее было характерно для этой системы в работе Мейера и др.. др.. Мы также продемонстрировали ковалентной иммобилизации ферментов интерес, спроектирован, чтобы содержать пользовательские пента-тирозин тег, чтобы хитозана в ферментативно-контролем. В частности, этот процесс при посредничестве фермента тирозиназы. Как показано на схеме на рис 5А (верхний), фермент, АИ-2-синтазы включает пяти-тирозин тегов. Тирозиназа действует на тирозин тег, окисляющие фенольные группы остатков "О-хинонов, которые затем ковалентно связываться с аминами хитозана в. Свидетельство хитозана фильм функционализации с АИ-2-синтазы тирозиназой сборки наблюдается на рис 5B </stРонг>, где АИ-2-синтазы был флуоресцентно меченных синий. Потому что АИ-2-синтазы генерирует АИ-2 от субстрата S-аденозил гомоцистеина (САК) точно так же, как отправитель клетки, ее близость к codeposited приемник клеток в присутствии САК также вызывает приемник клетки флуоресцентно реагировать, выражая DsRed (рис. 5А (ниже)). Красная флуоресценция приемник клеток (рис. 5В) в очередной раз демонстрирует взаимодействие между адресами в связи с распространением АИ-2 с одного на другой, и далее указывает, что ферменты, иммобилизованные на хитозана сохраняют активность раз ковалентно связаны. Рисунок 1. Альгинат электроосаждения. (А) механизм электроосаждения альгината: как электрод анодно предвзятым, электролиз воды происходит на ее поверхности, создавая локализованные низкий рН. Частиц карбоната кальция реагирует с избыткомпротонов, выпустив катионов кальция, как частицы растворяются. При наличии цепи полимера альгинат, ионы в хелатной "eggbox" сеть, образуя сшитый гидрогель на электроде. По мере удаления от электрода увеличивается, альгинат имеет большую тенденцию оставаться в растворе за счет снижения присутствии ионов кальция. (B) L-формы рисунком ITO электродов была использована для электролитическое альгината. PDMS и был зафиксирован на электрод содержит зеленый флуоресцентно-меченных альгината (1%) и CaCO 3 (0,5%) осаждения раствора. После электроосаждения в течение 2 мин. при плотности тока 3А / м 2, electroaddressed гидрогель альгинат удалось сфотографировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Рисунок 2. Соосаждения клеточных популяций. (А) Схема показывает взаимодействие между двумя E. палочки штамма: один население производит аутоиндуктор-2 (АИ-2), Сигнальную молекулу, и называется "АИ-2 отправителя". Остальным населением, называют "АИ-2 приемника", корреспондент АИ-2, после получения АИ-2 за счет диффузии из отправителя, она выражает красный флуоресцентный белок DsRed. (Б) красный флуоресценции изображение пары электродов с АИ-2 Отправитель населения codeposited с альгинат на левом электроде и АИ-2 приемника населения codeposited с альгинат на правом электроде. Увеличенный вид демонстрирует DsRed выражение только АИ-2 приемника. Рисунок 3. Хитозан электроосаждения. (А) Схема показывает зависит от рН электроосаждения хитозана. Электролиз воды в катодной предвзято электрода приводит к локализованным высоких значениях рН (показано локализованное изменение цвета красителя рН индикатор вблизи катода в микрофотография), который стимулирует золь-гель перехода хитозана в этом регионе. (B) амины представить на хитозана дают рН проблематику свойствами. Над рН 6.3 (рКа хитозана) амины депротонированного, способствуя переходу от его протонированных растворимой формы в нерастворимую форму ее гелем. (C) узорной золотой электрод был использован для электролитическое хитозана. Электрод, соединенный с катодной питания, была погружена в зеленый флуоресцентно-меченого хитозана (0,8%) осаждения раствора. После электроосаждения в течение 2 мин. при плотности тока 4 А / м 2, electroaddressed фильм хитозана удалось сфотографировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Рисунок 4. Электрохимический трансдукции с функциональными фильм хитозана. (А) Схематическое изображение установка из трех электродной системы. Функционализированных фильм хитозана служит в качестве рабочего электрода, платиновой проволоки, как счетчик электрода и Ag / AgCl в качестве электрода сравнения. Электрохимический трансдукции глюкозы проходит через йэлектронной ферментативных и электрохимических реакций показал, где производится перекись водорода может окисляться и обнаружил на рабочем электроде. (B) Циклические voltammagram (CV) на электрод с фильмом хитозана содержащие электрохимически сопряженных глюкозооксидазы (GOX) показывает сильный анодного сигнала в 5 мМ раствора глюкозы. Фильм, не содержащих GOX служила контролем и не проявляли сигнал в том же растворе. (C) между стандартной кривой анодного тока и концентрации глюкозы выводится почти линейная зависимость (каждую аликвоту увеличить концентрацию глюкозы на 4 мм, а также увеличение амплитуды тока на вставке в графе поэтапно). Рисунок 5. Белки функционализации использованием ферментативных сборки. (А, верхние) Схема показывает тирозин-тегом "АИ-2-синтазы" быть ковалентно привязанными к фильму хитозана сборки тирозиназы. Тирозину стали оксидized О-хинонов тирозиназой действия и может реагировать с аминогруппами на пленке хитозана, образуя ковалентную связь. (A, ниже) АИ-2-синтазы генерирует АИ-2 с подложкой (САК), приемник клетки сообщают созданные АИ-2, DsRed флуоресценции выражения. (B) Флуоресцентные изображения, показывающие фильм хитозана на золото, функциональными с голубой этикеткой АИ-2-синтазы. Смежно, АИ-2 клеток приемника codeposited с альгинат на ИТО. После добавления субстрата ферментативной к колодцу и инкубации, АИ-2 клеток приемник выражают DsRed.