Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em> In-situ</em> La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em> LacZ</em>-Etiquetados células tumorales

1. In-situ de perfusión pulmonar y fijación Anestesiar a ratones por inyección ip de ~ 150 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 112,5 mg / kg (peso corporal) de ketamina, xilazina 16,5 mg / kg, y 15 mg / kg de acepromazina (o por otro que contiene anestesia asesinos apropiadas dolor). Cuando los reflejos del ratón ya no se observan, fijarlo a la mesa de operaciones de back-abajo y humedecer la piel con un 70% de etanol a la mancha de los pelos hacia abajo. Abra la piel del abdomen hasta el cuello y tirar de ella hacia los lados o eliminarlo. Abra el peritoneo y el tórax de un tamaño amplio. Prevenir ruptura de los vasos grandes (por ejemplo, la vena yugular) para evitar la reducción de la eficiencia de la perfusión posterior. Cortar el caudalis vena cava por debajo del hígado. Use una jeringa de 20 ml equipado con un 21G – 24G aguja para inyectar despacio 10-15 ml de PBS en el ventrículo derecho del corazón batiendo hasta que el pulmón es completamente blanco yel corazón deja de latir (asistolia). Pellizque de los vasos sanguíneos por encima del hígado y el diafragma con una pinza vascular. Usar una jeringa de 10 ml equipado con un 21G – 24G aguja para inyectar ~ 2 ml de 3% de paraformaldehído (PFA) en PBS en el ventrículo derecho. Descubre la tráquea fuera del tórax. Usar la misma jeringa para inyectar ~ 3 ml de 3% de PFA en PBS craneal (fuera de tórax) en la tráquea hasta que el pulmón se infla. Inmediatamente después de la retirada de la aguja, pellizcar el caudal tráquea de la punción con una pinza vascular y esperar 10 minutos para permitir la fijación. Transecto los vasos sanguíneos por encima de la pinza vascular, quitar la abrazadera y inyectar ~ 2 ml de PBS en el ventrículo derecho a eliminar el exceso de PFA. Perforar las partes más bajas de todos los lóbulos pulmonares con una aguja, retirar la abrazadera vascular de la tráquea y se inyectan 3-5 ml de una solución de PolyFreeze medio de inclusión / PBS 1:1 en la tráquea caudal de la primera punción hasta que el PFA en la pulmónlóbulos se sustituye por la solución. Eliminar el pulmón cuidadosamente tirando del corazón con un fórceps y por transección ligamentos de tejido conectivo, vasos sanguíneos y la tráquea. Mantener el corazón conectado a los pulmones. Dependiendo de la forma de proceder con el análisis del tejido pulmonar continuar con los protocolos descritos en las secciones 2 o 3. Si usted quiere hacer ambos análisis, extraer un lóbulo pulmonar y siga el procedimiento descrito en el punto 3. Procesar los lóbulos restantes conectados al corazón como se describe en 2. 2. Visualización de lacZ-etiquetados células tumorales metastásicas en los lóbulos de pulmón completo Coloque el pulmón en un vaso de plástico con tapa de cierre hermético y fijarla con 2% de formaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 30-60 min. Elimine la solución de fijación y lavar a fondo 3 veces con PBS. Añadir al menos 10 ml recién preparada de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal) solución de tinción (X-Gal solución madre de [40 mg / ml enDimetilformamida] 1:40 diluido en solución de tinción Basic, pH 7,1 (Tabla 1); proteger de la luz). Poner un trozo de gasa en la parte superior del pulmón natación para mantenerlo completamente en la solución y colocar la tapa sólo débilmente en el bote para permitir el intercambio de aire. Incubar a 37 ° C durante 3-5 h protegida de la luz. Retire X-Gal solución, se lava una vez con PBS para eliminar los residuos de X-Gal solución (opcional) y añadir un 4% PFA. 3. Visualización de lacZ-etiquetados células tumorales metastásicas en pulmón criosecciones Prefill una incrustación de etiquetado molde a 1/3 con medio sin diluir incrustación PolyFreeze. Ponga el lóbulo pulmonar en la parte superior y se llenan de medio de inclusión hasta el lóbulo está completamente cubierto. Trate de evitar burbujas. Incubar los pulmones incrustados a 4 º C durante 20 min. Luego congelar los pulmones incrustados lentamente en una mezcla de hielo seco y isopentano y almacenar a -80 ° C. Cortar 7-10 micras criosecciones en un criostato y montarlos en portaobjetos de microscopio SuperFrostPlus. Incubar las secciones inmediatamente con solución de tinción X-Gal a 37 ° C durante 24 horas en una cámara humidificada. Enjuagar los portaobjetos en PBS 2 veces durante 5 min y, a continuación brevemente en agua destilada. Contra-tinción con rojo nuclear rápido durante 10-30 segundos, enjuague en agua destilada y montar las diapositivas con Immu-Mount. 4. Los resultados representativos Asai et al. Publicado en el artículo original en el modelo de Dunn-derivado LM8 ratón OS que los tumores sc primarios derivados de las células parentales Dunn, diferentes de los derivados de la altamente metastásico LM8 línea celular sub, no forman espontáneamente metástasis pulmonares detectables en syngeneic ratones C3H 14. Con las técnicas aquí reportados, se volvió a investigar la formación de metástasis en los modelos de ratón Dunn/LM8 OS. Nos aprovechamos de estable-lacZ transduced Dunn y celular LM8s y de un protocolo de perfusión pulmonar in-situ y fijación en ratones. Imágenes representativas de los pulmones perfundidos y no perfundido-de ratones por vía subcutánea inyectados con lacZ-transducidas y no transducidas de control Dunn y células LM8 se muestra en la figura 1. En los ratones inyectados con células de control Dunn, metástasis macroscópicas y microscópicas se mantuvo indetectable en los pulmones no perfundido y perfundido (Figura 1A, i-iv). Pero, curiosamente, en ratones inyectados con células Dunn-lacZ, X-gal tinción reveló azul micrometastásica focos de células individuales o de pequeños grupos de células (<0,1 mm) en la superficie de la no perfundidos pulmones (Figura 1A, vi). En- perfusión in situ y la fijación de los pulmones mejora aún más la capacidad de detección de micrometástasis Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). Sin embargo, a consecuencia macroscópica focos no se observó (Figura 1A, V, VII). </ P> En los ratones inyectados con células de control LM8, translúcido, apenas detectable macrometastatic focos mayor que 0,1 mm de diámetro fueron reconocidas en no perfundidos pulmones (Figura 1B, i). Perfusión del pulmón (Figura 1B, iii) no mejora la detección de los focos. Sin embargo, en ratones inyectados con células LM8-lacZ múltiples X-Gal manchado azul macro-(Figura 1B, v) y micrometástasis (Figura 1B, vi) se detectaron en la superficie de la no perfundidos órganos. Además, la perfusión de los pulmones mejora aún más la detectabilidad de macro-y micro-metástasis (Figura 1B, vii – viii). Por consiguiente, los micro-y macrometástasis se hizo visible a una densidad mayor y un número mayor, principalmente debido a la translucidez del tejido perfundido en el que los focos debajo de la superficie del órgano se convirtió también visible. Una hora adicionalanálisis istological utilizando criosecciones de tejido pulmonar confirmó la detectabilidad mejorada de metástasis pulmonares en los ratones inyectados con lacZ-transducidas Dunn y células LM8. En los ratones con tumores primarios derivados de Dunn-lacZ o células LM8-lacZ, a diferencia de en los ratones con tumores primarios de las células de control respectivos, micrometástasis o células incluso solo focos fueron reconocidos en secciones de pulmón (Figura 2). Además, macrometástasis eran también más claramente visible en los ratones inyectados con células LM8-lacZ que en los animales inyectados con el control LM8 células (Figura 2C, D). Figura 1. Detección de metástasis espontáneas de no transducidas (i-iv) y lacZ-transducidas (v-viii) Dunn (A) y LM8 (B) en las células no perfundido (i, ii, v, vi) y perfundido (iii, iv, vii, viii) los pulmones en ratones C3H. Metástasis en representante de X-Gal-staINED pulmones enteros (v, vii en A y B) y los respectivos primeros planos (VI, VIII en A y B) aparecen en azul. Macrometastatic focos (> 0,1 mm) en los órganos de ratones inyectados con los no etiquetados LM8 células (i-iv en B) se indican con asteriscos. Las áreas que se muestran en los primeros planos son representativos de los pulmones enteros. Las barras de escala indican 1 mm en las imágenes de todo el pulmón y 0,1 mm en los primeros planos. Haga clic aquí para ampliar la cifra . Figura 2. Detección de Dunn y LM8 micrometástasis en criosecciones de pulmón. Las secciones de tejido embebido octubre de pulmón se incubaron en solución de X-Gal tinción a 37 ° C durante 24 horas en una cámara húmeda y luego se contratiñeron con rojo nuclear rápido. Las flechas apuntan a micrometastásica focos reconocida en secciones de pulmón de ratones inyectados con Dunn-lacZ (B) o LM8-lacZ células (D). Micrometastases se mantuvo indetectable en secciones de pulmón de ratones inyectados con no transducidas Dunn (A) o LM8 células (C). Las barras de escala indican 0,1 mm.