Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em> In-situ</em> Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em> LacZ</em>-Tagged Células Tumorais

1. Perfusão Pulmonar In situ e Fixação Anestesiar ratos por injecção ip de 150 ul ~ fosfato salino tamponado (PBS) contendo 112,5 mg / kg (peso corporal) de cetamina, xilazina 16,5 mg / kg e 15 mg / kg de acepromazina (ou por um outro anestésico contendo analgésicos adequados). Quando os reflexos do mouse já não são observadas, corrigi-lo na mesa de operação de volta para baixo e molhar a pele com etanol 70% para os cabelos lisos para baixo. Abrir a pele do abdómen até ao pescoço e puxá-la para os lados ou removê-lo. Abra o peritônio eo tórax de um amplo tamanho. Impedir rupturas de grandes vasos (por exemplo, a veia jugular) para evitar a redução da eficiência da perfusão subsequente. Cortar a veia cava caudal abaixo do fígado. Usar uma seringa de 20 ml equipado com um 21G – agulha 24G para injectar lentamente 10-15 ml de PBS para dentro do ventrículo direito do coração a bater até que o pulmão é completamente branco eo coração pára de bater (assistolia). Beliscar fora dos vasos sanguíneos acima do fígado e do diafragma, com uma pinça vascular. Use uma seringa de 10 ml equipado com um 21G – agulha 24G para injectar ~ 2 ml de paraformaldeído a 3% (PFA) em PBS para o ventrículo direito. Descobrir a traqueia fora do tórax. Usar a mesma seringa para injectar ~ 3 ml de 3% de PFA em PBS cranial (do lado de fora do tórax) na traqueia até o pulmão é insuflado. Imediatamente após a remoção da agulha, belisque da cauda traqueia de punção com uma pinça vascular e aguardar durante 10 minutos para permitir a fixação. Transecão os vasos sanguíneos acima do grampo vascular, remover o grampo e injectar ~ 2 ml de PBS para o ventrículo direito para remover o excesso de PFA. Punção as partes inferiores de todos os lobos pulmonares com uma agulha, retirar a pinça vascular na traqueia e injectar 3-5 ml de uma solução de PolyFreeze incorporação médio / PBS 1:1 para o caudal da traqueia da primeira punção até o PFA no pulmãolóbulos é substituída pela solução. Retire cuidadosamente o pulmão puxando o coração com uma pinça e atravessa em ligamentos do tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e da traquéia. Manter o coração ligado para os pulmões. Dependendo de como proceder com a análise do tecido pulmonar continuar com os protocolos descritos nas secções 2 ou 3. Se você quer fazer ambas as análises, remover um lobo do pulmão e proceder conforme descrito em 3. Processar os restantes lóbulos ligados ao coração, tal como descrito no ponto 2. 2. Visualização de lacZ-marcadas células tumorais metastáticas em lobos pulmonares inteiras Coloque o pulmão num copo de plástico com tampa de fecho estanque e fixá-lo com formaldeído a 2% em PBS à temperatura ambiente durante 30-60 min. Remover solução fixadora e lavam cuidadosamente 3 vezes com PBS. Adicionar pelo menos 10 ml preparada de fresco de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal), a coloração da solução (solução stock X-Gal [40 mg / ml emDimetilformamida] 01:40 diluído em solução de coloração básico, pH 7,1 (Tabela 1), proteger da luz). Colocar um pedaço de gaze na parte superior do pulmão de natação para mantê-la completamente na solução e colocar a tampa apenas frouxamente sobre o pote para permitir a troca de ar. Incubar a 37 ° C durante 3-5 hr protegido da luz. Remover X-Gal solução, lavar uma vez com PBS para remover a solução de X-Gal residual (opcional) e adicionar PFA a 4%. 3. Visualização de lacZ-tagged células tumorais metastáticas em criocortes Pulmonares Prefill um molde de encaixe marcado a 1/3 com meio não diluído PolyFreeze incorporação. Coloque o lobo em cima e encher-se com a incorporação médio até que o lobo está completamente coberto. Tente evitar bolhas. Incubar os pulmões incorporados a 4 ° C durante 20 min. Em seguida, congelar os pulmões incorporados lentamente em uma mistura de gelo seco e isopentano e armazenar a -80 ° C. Corte 7-10 mM crioseções em um criostato e montá-los em lâminas de microscópio SuperFrostPlus. Incubar as secções imediatamente com X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida. Enxaguar as lâminas em PBS 2 vezes durante 5 min e, em seguida, brevemente em água destilada. Counter-mancha de vermelho rápido nuclear por 10-30 segundos, lavar em água destilada e montar as lâminas com Carac-Monte. 4. Resultados representativos Asai et al. Relatada no artigo original sobre o derivado Dunn-modelo de rato LM8 OS que os tumores sc primárias derivadas das células parentais de Dunn, diferentes dos derivados da linha de células altamente metastáticas LM8 sub, não formam espontaneamente metástases pulmonares em detectáveis ratinhos C3H singénicos 14. Com as técnicas aqui relatadas, que de novo inquérito a formação de metástases nas Dunn/LM8 modelos do rato do SO. Nós aproveitou estável lacZ transduzidas Dunn e LM8 celulars e de um protocolo para a in-situ de perfusão pulmonar e fixação em ratinhos. Imagens representativas de pulmões perfundidos e não perfundido de ratos injectados subcutaneamente com lacZ-transduzidas e não transduzidas de controlo Dunn e LM8 células são mostradas na Figura 1. Nos ratinhos injectados com células de controlo Dunn, metástases macroscópicas e microscópicas permaneceu indetectável no pulmão não-perfundidos e perfundido (Figura 1A, i-iv). Mas, curiosamente, em ratinhos injectados com células de Dunn-lacZ, X-gal revelou coloração azul micrometastático focos de células individuais ou grupos de células pequenas (<0,1 mm), na superfície do não-perfundidos pulmões (Figura 1A, vi). In- perfusão in situ e fixação dos pulmões melhorou a detecção de micrometástases Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). No entanto, a excrescência focos macroscópico não foi observado (Figura 1A, v, vii). </ P> Nos ratinhos injectados com células de controlo LM8, translúcidas, dificilmente detectável macrometastatic focos maiores do que 0,1 mm de diâmetro foram reconhecidos em não-perfundidos pulmões (Figura 1B, i). Perfusão do pulmão (Figura 1B, iii) não melhorou a detecção de focos. No entanto, em ratinhos injectados com LM8-lacZ várias células X-Gal azul manchado macro-(Figura 1B, v) e micrometástases (Figura 1B, vi) foram detectados na superfície do não-perfundidos órgãos. Além disso, a perfusão dos pulmões melhorou a detectabilidade de macro-e micrometástases (Figura 1B, vii – viii). Consequentemente, as micro-e macrometástases tornou visível a uma densidade mais elevada e um número maior, principalmente devido à transparência do tecido perfundido de focos em que por baixo da superfície de órgãos tornou-se também visível. Um h adicionalanálise istological usando criocortes de tecido pulmonar confirmou a detectabilidade melhorada de metástases pulmonares em ratinhos injectados com lacZ-transduzidas Dunn e LM8 células. Nos ratinhos com tumores primários derivados de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ células, ao contrário dos camundongos com tumores primários das células de controlo respectivos, micrometástases ou mesmo única célula focos foram reconhecidos em secções de pulmão (Figura 2). Além disso, também foram macrometástases mais claramente visíveis em ratinhos injectados com células LM8-lacZ do que em animais injectados com o controlo LM8 células (Figura 2C e D). Figura 1. Detecção de metástases espontâneas de não transduzidas (i-iv) e lacZ transduzidas (v-viii) Dunn (A) e LM8 (B) células não perfundido (i, ii, v, vi) e perfundida (iii, iv, vii, viii) nos pulmões de ratinhos C3H. Metástases em representante X-Gal-staINED pulmões inteiros (V, VII, em A e B) e respectivo close-ups (VI, VIII em A e B) aparecem em azul. Macrometastatic focos (> 0,1 mm) nos órgãos de ratos injetados com os não-etiquetados LM8 células (i-iv em B) são indicados por asteriscos. Áreas mostradas em close-ups são representativos para os pulmões inteiros. Barras de escala indicam um milímetro em imagens de pulmões inteiros e 0,1 mm de close-ups. Clique aqui para ver maior figura . Figura 2. Detecção de Dunn e LM8 micrometástases em criocortes de pulmão. Secções de tecido de pulmão outubro embedded foram incubadas em X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida e, em seguida, contrastadas com vermelho nuclear rápido. As setas apontam para os focos micrometastático reconhecido em secções de pulmão de ratos injectados com Dunn-lacZ (B), ou células LM8-lacZ (D). Micrometastases permaneceu indetectável em secções de pulmão de ratos injectados com não transduzidas Dunn (A) ou LM8 células (C). Barras de escala indicam 0,1 mm.