הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים
Summary
ההגברה מחזורית misfolding חלבון (PMCA) היא assay במבחנה לחקר גיור פריון ומחסומי מתח ומינים. זה גם יכול לשמש כבדיקת גילוי פריונים.
Abstract
פריונים הם גורמים מזהמים שגורמים ספג המוח המסיר תמיד הקטלני (TSE) בחיות ובני אדם 9,18. חלבון הפריון יש שני isoforms השונה, חלבון שאינו מדבק מארח בקידוד (PRP C) וחלבון המדבק (PRP Sc), איזופורם חריג מקופל של PRP C 8.
אחד האתגרים של עבודה עם סוכני פריונים הוא תקופת הדגירה הארוכה לפני התפתחות סימנים קליניים לאחר חיסון מארח 13. זה מנדט מסורתי מחקרי אסיי לבעלי חיים ארוכים ויקרים. יתר על כן, את התכונות הביוכימיות וbiophysical של PRP Sc מאופיינות גרוע עקב מצבי הצבירה קונפורמציה ויוצאת הדופן שלהם.
PRP Sc יכול לזרוע את ההמרה של PRP C כדי PRP Sc במבחנה 14. PMCA היא טכניקה במבחנה שלוקחת אדוהntage של יכולת זו באמצעות מחזורי sonication ודגירה כדי לייצר כמויות גדולות של PRP Sc, בקצב מואץ, ממערכת המכילה כמויות עודפות של PRP C וכמויות זעירות של זרע PRP Sc 19. טכניקה זו הוכיחה את היעילות לסכם את הספציפיות מינים וזן של PRP Sc המרה מPRP C, לחקות הפרעות מתח פריון, וכדי להגביר את הרמות נמוכות מאוד של PRP Sc מרקמות נגועות, נוזלים, ודגימות סביבתיות 6,7,16, 23.
פרטי נייר זה פרוטוקול PMCA, כולל המלצות לצמצום זיהום, שהניב תוצאות עקביות, וכימות תוצאות אלה. גם אנחנו דנים כמה יישומי PMCA, כולל דור ואפיון של זני זיהומיות פריון, הפרעות מתח פריון, וזיהוי של פריונים בסביבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אתגרים של חלבוני פריונים זיהומיות הגברה הם תקופות ארוכות דגירה וההוצאות של בניסויי vivo. טכניקת PMCA היא אמצעי חסכוני לסוכנים להגביר את פריון זיהומיות. מספר מעבדות שאשרו את היכולת של PMCA במדויק כדי להגביר זני פריון במבחנה 7, 9, 12, 14, 19,24.
<p class="jove_content" style=";text…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר Vesper פה מארי ראמוס לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 וG20RR024001) ומכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (2R01 NS052609).
Materials
| Reagent / Equipment | Manufacturer | Cat. Number |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 |
| Tenbroeck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
- Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
- Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
- Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
- Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
- Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
- Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
- Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
- Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
- Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
- Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
- Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
- Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
- Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
- Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
- Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
- Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
- Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
- Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).
