Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme
Summary
Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.
Abstract
Yeni fonksiyonel nöronlar yapısal yetişkin memeli beyninde kısıtlı alanlarda nöral kök hücrelerinin endojen bir havuz oluşturulur gösteren kanıt önemli bir gövdesi vardır. Subventricular zon (SVZ) den Yenidoğan nöroblast koku ampul (OB) 1 nihai hedefe rostral göç akışı (RMS) boyunca göç. RMS'de, nöroblast bir yapısal destek ve göç 4,5 için gereken moleküler faktörü kaynağı olarak kan damarlarının kullanılarak astrositik işlemler 2,3 göre ensheathed zincirleri teğetsel göç ederler. OB, nöroblast zincirleri ayırmak ve internöron içine ayırt etmek ve mevcut ağ 1, 6 entegre farklı bulber katmanları içine radyal olarak göç ederler.
Bu yazıda kemirgen beynindeki akut dilimleri izleme hücre göçü için prosedürü açıklar. Akut dilimlerinin kullanılması assessm sağlaryakından vivo koşullarda ve in vivo görüntüleme için ulaşılması zor beyin bölgelerinde andıran bu mikroçevresindeki hücre göçü ent. Buna ek olarak, sonuçta hücre göçü özelliklerini değiştirebilir organotipik ve hücre kültürlerinin olduğu gibi uzun kültür kalıntıları önler. Akut dilimler Nöronal öncüleri DIC optik ya da floresan proteinleri kullanılarak görüntülenebilir. Wild-tip farelerden SVZ'da içine muhabiri fareler nöroblast aşılama ve nöroblast floresan proteini ifade transgenik fareler kullanarak SVZ nöronal öncüllerinin Viral etiketleme, nöroblast görselleştirme ve göç sonrası için tüm uygun yöntemlerdir. Daha sonra yöntem, ancak tek tek hücreler çünkü işaretli hücrelerin yüksek yoğunluklu uzun süre için izlenen izin vermez. Biz nispeten hızlı bir toplama aralığı (bir ima ulaşmak için bir CCD kamera ile donatılmış geniş bir alan floresan dik mikroskop kullanılırge her 15 veya 30 sn) güvenilir sabit ve göçmen fazları belirlemek için. Kırtasiye ve göçmen fazların süresinin kesin tanımlama sonuçlarının kesin yorumlanması için çok önemlidir. Biz aynı zamanda 3D nöroblast göç izlemek için birden z-aşamalı alımlar gerçekleştirilir. Geniş alan floresan görüntüleme nöronal migrasyon 7-10 görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, biz, nöroblast etiketleme yetişkin fare önbeyin akut dilimleri neuroblast göçün gerçek zamanlı video görüntüleme gerçekleştirerek ve hücre göçü analiz etmek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Açıklanan protokol yetişkin RMS nöroblast göç örnek, aynı zamanda, embriyonik ve erken doğum sonrası beyin hücre göçü takip etmek için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Uygun beyin bölgelerine nöronal öncüllerinin doğru hedefleme nöral devrelerin düzgün montaj ve fonksiyonu altında yatan temel bir süreçtir. Hücrelerin büyük çoğunluğu embriyonik gelişim sırasında göç ve sadece bu OB, dentat girus ve beyincik gibi birkaç bölgelerde doğum sonrası beyindeki nöronal yerinden hala yer alır. Postnatal beyin hücre göçü düzenlediğini mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır, ancak kalır. Olgun sinir dokularında hücre göçü rehberlik dahil mekanizmalar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Université Laval burs tarafından desteklenmiştir ASJK için Sağlık Araştırması (CIHR) hibe Kanadalı Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. AS Postnatal nörogenez bir Kanada Araştırma Başkanı sahibidir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
