Time-lapse avbildning av Neuroblast Migration i akuta skivor av vuxen mus framhjärnan

Det finns en avsevärd mängd bevis för att nya funktionella nervceller konstitutivt genereras från en endogen pool av neurala stamceller i begränsade områden av den vuxna däggdjur hjärnan. Nyfödda neuroblaster från subventrikulära zonen (SVZ) vandrar längs rostrala vandrande ström (RMS) till slutdestinationen i luktbulben (OB) ^1. I RMS, neuroblaster vandrar tangentiellt i kedjor ensheathed av astrocytiska processer ^2,3 med blodkärl som strukturellt stöd och en källa av molekylära faktorer som krävs för migration ^4,5. I OB, neuroblaster lossna från kedjorna och migrera radiellt in i de olika bulbära lagren där de differentierar till interneuronen och integreras i det befintliga nätet ^{1, 6.}

I detta manuskript beskriver vi proceduren för övervakning cellmigration vid akuta skivor av gnagare hjärnan. Användningen av akut skivor låter assessment av cellmigration i mikromiljön som nära liknar till in vivo förhållanden och i hjärnan regioner som är svåra att komma åt för in vivo imaging. Dessutom undviker man långa odling skick som i fallet med organotypiska och cellkulturer som så småningom kan ändra migration egenskaper cellerna. Neuronala prekursorer i akuta skivor kan visualiseras med användning av DIC optik eller fluorescerande proteiner. Viral märkning av neuronala prekursorer i SVZ, ympning neuroblaster från reporter möss i SVZ av vildtypsmöss, och användning av transgena möss som uttrycker fluorescerande protein i neuroblaster är alla lämpliga metoder för att visualisera neuroblaster och efter deras migrering. Den senare metoden, emellertid, inte tillåter individuella celler som skall spåras under långa tidsperioder på grund av den höga densiteten av märkta celler. Vi använde ett brett fält fluorescerande upprätt mikroskop utrustat med en CCD-kamera för att uppnå en relativt snabb förvärv intervall (ett imaGE var 15 eller 30 sekunder) att tillförlitligt identifiera stationära och migrerande faser. En exakt identifiering av den tid de stationära och vandrande faser är avgörande för entydig tolkning av resultaten. Vi utförde också flera z-steg förvärv för att övervaka neuroblaster migration i 3D. Wide-området fluorescerande avbildning har använts i stor utsträckning för att visualisera neuronala migration ^7-10. Här beskriver vi detaljerat protokoll för märkning neuroblaster, utför realtidsvideo-avbildning av neuroblast migration i akuta skivor av den vuxna musen framhjärnan och analysera cellmigration. Medan den beskrivna protokoll exemplifieras migration av neuroblaster i vuxna RMS, kan den också användas för att följa cellmigration i embryonala och tidiga postnatala hjärnor.