تحريض الإشارات التصاق التي تعتمد على استخدام الموجات فوق الصوتية المنخفضة الحدة
Summary
يصف هذا بروتوكول تحفيز الخلايا الليفية مثقف مع الموجات فوق الصوتية المنخفضة الحدة نابض، وهو ما يدفع التنسيق تشكيل التصاق وRac1 تفعيل عن طريق محاكاة إشراك عبر الغشاء مستقبلات مصفوفة، syndecan-4. ويسمح هذا النهج من التحقيق تقنية السريرية ناجح على المستوى الخلوي، وبالتالي توفير فرص للتحسين من العلاج.
Abstract
في الكائنات متعددة الخلايا، وتملي سلوك الخلية عن طريق التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية. نتائج مصفوفة الارتباط مجموعة من تنظيم الهجرة الخلية، وانتشار الأسلحة النووية، إلى إفراز وحتى التفريق. الإشارات الكامنة وراء كل من هذه العمليات المعقدة تنشأ من التفاعلات الجزيئية من مستقبلات المصفوفة خارج الخلية على سطح الخلية. integrins يست المستقبلات prototypic وتقديم وصلة ميكانيكية بين المصفوفة خارج الخلية والهيكل الخلوي، وكذلك الشروع في بعض من أجهزة الطرد المركزي التي تعتمد على الالتصاق مما يشير. ومع ذلك، فإنه بات من الواضح بشكل متزايد أن مستقبلات عبر الغشاء إضافية تعمل جنبا إلى جنب مع لل integrins لتنظيم كل من إنتغرين نفسها وإشارات المصب. وأكثر أناقة من هذه الأمثلة هو بروتيوغليكان عبر الغشاء، syndecan-4، والتي تتعاون مع β α 5 1-إنتغرين خلال التصاق إلى فبرونيكتين. في النماذج الحية demonstrأكلت على أهمية إشارات-4 syndecan، كما syndecan-4-خروج المغلوب الفئران تبدي تخلف الشفاء بسبب عدم كفاءة الخلايا الليفية 1،2 الهجرة. في البرية من نوع الحيوانات، ويتم تشغيل الهجرة من الخلايا الليفية نحو الجرح من قبل ظهور فبرونيكتين أن يترسب تتسرب من الشعيرات الدموية التالفة والتي الضامة في النسيج المصاب. ولذلك هناك اهتمام كبير في اكتشاف الاستراتيجيات التي تعزز فبرونيكتين التي تعتمد على الإشارات، ويمكن تسريع عمليات الإصلاح.
ويمكن فصل مكونات إنتغرين بوساطة وsyndecan-4-بوساطة من فبرونيكتين التي تعتمد على إشارات من الخلايا المحفزة مع شظايا فبرونيكتين المؤتلف. على الرغم من أن إنتغرين المشاركة أمر ضروري للالتصاق الخلية، وينظم بعض فبرونيكتين التي تعتمد على الاشارات التي syndecan-4. Syndecan-4 ينشط إشارة Rac1 تبارزي 3، يسبب إنتغرين إعادة توزيع 1، مشغلات تجنيد جزيئات هيكل الخلية، مثل vinculin، إلى التنسيقالتصاقات 4، ويدفع بذلك الاتجاه 3 هجرة. كنا نبحث عن استراتيجيات بديلة لتفعيل مثل هذه الاشارات، ووجدت أن الموجات فوق الصوتية المنخفضة الحدة نابض (LIPUS) يمكن أن تحاكي آثار الاشتباك-4 syndecan 5. في هذا البروتوكول وصفنا الطريقة التي يمكن تطبيقها على 30 ميغاواط / سم 2، 1.5 ميغاهيرتز الموجات فوق الصوتية، نابض في 1 كيلو هرتز (الشكل 1) إلى الخلايا الليفية في ثقافة (الشكل 2) للحث على Rac1 التنشيط والتنسيق تشكيل الالتصاق. يتم تطبيق التحفيز الموجات فوق الصوتية لمدة أقصاها 20 دقيقة، كما تم العثور على هذه المجموعة من المعلمات لتكون الأكثر فعالية لتسريع اصلاح كسر السريرية 6. ويستخدم أسلوب شظايا فبرونيكتين المؤتلف للانخراط α β 5 1-إنتغرين، دون إشراك syndecan-4، ويتطلب تثبيط تخليق البروتين بواسطة سيكلوهيكسيميد لمنع ترسب مصفوفة إضافية من الخلايا الليفية.، وتأثير إيجابي سموثق بشكل جيد و الموجات فوق الصوتية على آليات إصلاح 7،8، و من خلال فهم تأثير الجزيئية الموجات فوق الصوتية في الثقافة يجب أن نكون قادرين على صقل هذه التقنية العلاجية لتحسين النتائج السريرية.
Protocol
Discussion
في هذا البروتوكول وصفنا الطريقة التي يمكن استخدامها لعلاج الذي يتم تطبيقه عادة للمرضى الإنسان في الخلية المستندة إلى التجارب. والهدف النهائي هو لفهم الآلية الجزيئية للعمل الموجات فوق الصوتية بحيث يمكن أن يتم تكريره في العلاج. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) كنموذج نظام الخلية، ولكن لم يتم العثور على الموجات فوق الصوتية أيضا أن تكون فعالة في الخلايا الليفية الأولية القلفة الإنسان 5، والخلايا الجذعية الوسيطة، وبانيات غضروفية 6. نحن نستخدم Rac1 تفعيل باعتباره فحص سبيل المثال الكيمياء الحيوية، ولكن يمكن استخدام أسلوب بالتساوي لاختبار تنظيم الفسفرة البروتين أو تشكيل مجمعات البروتين بواسطة مناعي. للمثال مناعي نظهر تأثير الموجات فوق الصوتية على تشكيل التصاق التنسيق، ولكن يمكن دراسة إعادة توزيع أي جزيء. على سبيل المثال، يمكن للمرء اختبار توظيف العوامل عصاري خلوي إلى غشاء البلازما، colocalisation من المتواجدالإضافية في الحويصلات الاتجار أو دراسة تأثير الموجات فوق الصوتية في منظمة مغزل الإنقسامية. حتى الآن لم يقتصر أنفسنا لاختبار فبرونيكتين التي تعتمد على المسارات، وذلك من تأثير الموجات فوق الصوتية على الخلايا على الكولاجين، أو في وجود عوامل النمو يمكن اختبار لبناء صورة لكيفية الموجات فوق الصوتية يؤثر على سلوك الخلية في بيئة معقدة أكثر يشبه وضعا في الجسم الحي. وسوف يكون أكبر تحد لاختبار تأثير الموجات فوق الصوتية باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير، حيث وجود باعث عرقلة مسار الضوء والاهتزازات من العقبات الموجات فوق الصوتية الحالي فنية إضافية. ومع ذلك، فإن حقيقة أن تطبيق العلاج يتطلب 20 دقيقة فقط في اليوم الواحد من التحفيز يشير إلى أن تحليل سلوك الخلية بعد موجة من التحفيز قد تكون مثمرة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل منحة ويلكوم ترست 088419 إلى MDB ورعايته من قبل سميث ونفيو المحدودة في المملكة المتحدة
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
| hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| EDTA | Sigma | E5134 |
References
- Bass, M. D. A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis. Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).
- Echtermeyer, F. Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4. J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).
- Bass, M. D. Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix. J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).
- Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments. Embo. J. 5, 665-670 (1986).
- Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1. J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).
- Claes, L., Willie, B. The enhancement of bone regeneration by ultrasound. Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).
- Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound. J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).
- Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study. J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).
- Danen, E. H. Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1. J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).
- Makarem, R. Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1. J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).
