Indução de Sinais de adesão dependentes Usando ultra-som de baixa intensidade

1. As superfícies de revestimento com o ligando Matrix O ultra-som será aplicado a células em 3,5 cm de poços, quer como pratos individuais ou como uma placa de 6 poços. Para ensaios bioquímicos ligando revestimento, directamente sobre o plástico. Para imunofluorescência, vidro fervura lamelas três vezes em água e MilliQ lugar 4 lamelas para o fundo de cada poço. As superfícies de vidro deve ser derivatizados para assegurar revestimento ligante eficiente. Dissolver sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide éster em PBS a 1 mM. Adicionar 2 ml a cada poço e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lave as superfícies derivatizados 3 vezes com PBS. Casaco, quer de vidro ou de plástico não tratada derivatizado com o ligando de integrina. Aplicar 2 ml de 10 ug / ml integrina ligand9, dissolvido em PBS contendo Ca 2 + e Mg 2 + a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C. Preparar monoparticulate BSA por aquecimento BSA a 1%, dissolvido em PBS, a 85 ° C durante 13 minutos. Permitirarrefecer e então passar através de um filtro de 0,45 mícrons. Lavar-ligando superfícies revestidas com 3 vezes com PBS e bloqueio com BSA a monoparticulate durante 30 minutos. 2. Preparação de Células Para controlar o ambiente da matriz ao longo da experiência, a síntese de proteína deve ser bloqueada por adição de 25 cicloheximida ug / ml a 80% confluentes de fibroblastos durante 2 horas. Lavar cicloheximida células tratadas com PBS e destacar do frasco de cultura utilizando 0,5 mg / ml de tripsina / EDTA. As células destacadas de colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 minutos. Ressuspender as células em DMEM/25 mM de HEPES, 25 ug / ml cicloheximida. Contar densidade celular da suspensão usando um hemocitómetro e diluir até 105 ml-1. Incubar as células a 37 ° C durante 20 minutos para recuperar a integrina de superfície. Enxaguar o ligando-revestido, BSA-bloqueados poços 3 vezes com PBS. Ml de sementes 2 da suspensão de células em cada poço. Allocélulas w para espalhar durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. 3. Estimulação ultra-som Aqueceu-se a matriz emissor de ultra-som e gel de acoplamento para 37 ° C. Aplique uma gota do tamanho de ervilha de acoplamento gel para cada emissor. Teste que cada emissor é funcional usando um detector de ultra-som diodo indicador. Colocar os poços na matriz emissor. Retornar matriz para 37 ° C, 5% de CO 2 a temperatura e deixa-se equilibrar durante 10 minutos. Ligue o sinal de ultra-som. O sinal de ultra-som desactivará após 20 minutos, imitando o regime terapêutico. Se os tempos mais curtos de estimulação são necessárias, as chapas devem ser removidos da matriz no momento apropriado de pontos. Em todos os casos usar não estimulada placas, como controlo negativo. 4. Análise de Adesão Focal por imunofluorescência Para a análise de formação de adesão focal, aplicar o sinal de ultra-som 20 minutose então permitir que as estruturas para desenvolver durante mais 40 minutos, mantendo as células a 37 ° C, 5% de CO 2. Aspirar meios de comunicação e fixar as células mediante a aplicação de 2 ml de paraformaldeído a 4% em PBS. Incubar durante 14 minutos à temperatura ambiente. Aspirar paraformaldeído e lavar três vezes com PBS, aplicando o PBS suavemente para baixo da borda do poço para evitar a geração de forças de cisalhamento. Transfira cada lamela a partir dos 3,5 cm bem a uma placa de 24 cavidades para a coloração de imunofluorescência subsequente. Têmpera paraformaldeído residual mediante a aplicação de 0,5 ml 0,1 M glicina em PBS a cada um dos 24 poços. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Aspirado glicina e enxaguar três vezes com PBS. Permeabilise células mediante a aplicação de 0,5 ml de Triton 0,5% X-100 (w / v) em PBS. Incubar durante 4 minutos à temperatura ambiente. Aspirado Triton X-100 e enxaguar três vezes com PBS. Bloquear mediante a aplicação de 0,5 ml de 3% (w / v) de BSA em PBS. Incubar durante uma noite a 4 & dpor exemplo; C. Stain vinculina contendo adesão focal com hVIN-1 anticorpo diluído 1:400 em bloco de BSA. Incubar durante uma hora à temperatura ambiente. Lavar três vezes com PBS. Aplicar fluoróforo (DyLight 488) anticorpo secundário conjugado (diluído 1:200) e actina mancha com TRITC-faloidin conjugado (diluído 1:200) no bloco de BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lavar três vezes com PBS, e uma vez com água. Montar em uma lâmina de vidro em uma posição invertida usando Prolongar montagem Gold. 5. Quantificação de Rac1 Ativação por Pull-down Ensaio Para a análise de Rac1 activação, aplicar o sinal de ultra-som de 20 minutos para as células a 37 ° C, 5% de CO 2. Ao avaliar os tempos de resposta mais longos do que 20 minutos, aplicar o sinal de ultra-som durante 20 minutos e manter as células a 37 ° C, 5% de CO2 durante o tempo restante para permitir que a resposta para se desenvolver. Aspirar e mídia local bems em gelo. Lavar os poços com 2 ml de PBS frio e aspirado. Garantir qualquer PBS residual é removido, deixando poços inclinado para 1 minuto, seguido por aspiração completa. Lisar as células em gelo com 35 uL de tampão de lise (10% de glicerol, 20 mM de Hepes pH 7,4, 140 mM de NaCl, 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sódio, 4 mM de EGTA, 4 mM de EDTA, 1 × inibidor da protease completa) por poço. Neste exemplo, 6 poços são utilizados por ponto de tempo para gerar uL 210 de lisado de células. Mais poços ou menos podem ser utilizados, mas o volume total deve lisado total de ~ 200 uL. Células Scrape cuidadosamente com raspador de células a fim de assegurar a lise das células completas e deixar poços inclinado durante 1 minuto para permitir lisado para a piscina. Transferir para um lisado gelada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (pooling lisados ​​a partir de regime de tratamento mesma) e centrifugação a 21.000 xg durante 2 minutos a 4 ° C para sedimentar os restos celulares. Transferir 180 uL de lisado de gelada tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 130 ul de tampão de lise e 25 uL PAK-glutpérolas de agarose athione 10. Manter restante lisado bruto a -20 ° C para a separação de gel subsequente. Capturar Rac1 activo sobre os grânulos de agarose de glutationa-PAK pela rotação tubos durante 40 minutos a 4 ° C. Colheita de agarose grânulo conjugados por centrifugação a 2000 × g durante 1 minuto a 4 ° C. Lavagem grânulo conjuga três vezes com 500 uL de tampão de lise, a colheita grânulos por centrifugação a 2000x g sobrenadante e descartando depois de cada lavagem. Cuidadosamente remover qualquer tampão de lavagem restante lise com uma pipeta de 200 uL. Eluir cada amostra por adição de 35 uL de tampão de carregamento de SDS-PAGE e incubar a 85 ° C em um bloco de aquecimento com agitação durante 5 minutos. Remover grânulos por centrifugação a 21.000 xg durante 1 minuto. Resolver eluato grânulo por SDS-PAGE, transferência para nitrocelulose e sonda para a Rac1. 6. Os resultados representativos Neste protocolo, descrevemos a indução de vinculina-manchaed adesões focais e Rac1 atividade por ultra-som. Para a experiência de adesão focal, a posição de linha de base é que os fibroblastos, distribuídos sobre um ligando de α β 5 1-integrina não formam vinculina contendo aderências (Fig. 3A), a menos que um receptor de fibronectina em segundo lugar, sindecam-4, está envolvida por adição de ligando solúvel (Fig. 3B) 3,4. No entanto, a estimulação com ultra-som induz a formação de adesão focal para a mesma extensão como acoplamento de sindecam-4 (Fig. 3C), indicando que a estimulação de ultra-som pode substituir determinados componentes da via de sinalização de fibronectina-dependente 5. O principal obstáculo com este protocolo está eliminando a formação de adesão focal na ausência de estimulantes. Inibição da síntese de proteínas incompleta por cicloheximida irá permitir a deposição de matriz que é suficiente para que as células auto-estimular. Superlotação de células pode também conduzir a baixo nível de adesão focal formation e uma má resposta ao ultra-som como crosstalk entre célula-célula e célula-matriz de contatos vai complicar um experimento que foi projetado para isolar um único estímulo. Como um desenvolvimento do ensaio básico que mostram a mesma experiência, repetiu com fibroblastos que faltam sindecam-4 (Fig. 4). Estes fibroblastos ainda respondem aos ultra-sons (Fig. 4C), mas não respondem ao sindecam-4 ligando (Fig. 4B). O experimento utilizando Sdc4 – / – fibroblastos demonstra que o ultrassom pode realmente ignorar a necessidade de receptores de fibronectina certas, e ilustra como o protocolo simples podem ser desenvolvidos para obter informações adicionais sobre a via de sinalização. Para a experiência bioquímica demonstramos que ultra-som pode induzir activação de Rac1, utilizando um ensaio de pull-down que é uma adaptação do método descrito por Del Pozo et al. 10. Precipitação do activo Rac1 0, 10, 30 e 60 minutos após iniciação de estimulação de ultra-som revela que Rac1 picos de actividade em 10-30 minutos, antes de retornar à linha de base (Fig. 5). Blotting lisados ​​bruto para vinculina garante carregamento equivalente entre os pontos de tempo. O resultado assemelha-se a ativação de Rac1 pelo engajamento de sindecam-4 3, mas é um pouco mais prolongada do que a ativação pela fibronectina. Portanto 8-10 repete são normalmente necessários para a obtenção de dados significativos. Ativação de Rac1 é responsável por compromisso de células para a formação de adesão focal e nascentes adesões focais começam a se formar em 10-30 minutos, coincidindo com Rac1 ativação. Uma vez iniciado, essas aderências continuará a amadurecer em placas de adesão das grandes mostradas nas Figuras 3 e 4. Figura 1. A forma de onda de ultra-som. O ultra-som é composto por um sinal intermitente 1,5 MHz que, devido à baixa amplitude (30 mW / cm <sup> 2, média espacial, a média temporal) não tem efeito de aquecimento. Figura 2. Representação esquemática do fluxo de trabalho para preparação e estimulação de células com ultra-som. Figura 3. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos. Os fibroblastos foram espalhados sobre o fragmento de integrina de ligação da fibronectina (A) antes da estimulação com o fragmento de sindecam-4-a ligação da fibronectina (B) ou de ultra-som (C). Após 60 minutos de estimulação, as células foram fixadas, coradas para vinculina e actina, e fotografada pela epifluorescência. Barra = 10 uM. Figura 4. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos falta sindecam-4. <em> Sdc4 – / – fibroblastos foram espalhados sobre o fragmento de integrina de ligação da fibronectina (A) antes da estimulação com o fragmento de sindecam-4-a ligação da fibronectina (B) ou de ultra-som (C). Após 60 minutos de estimulação, as células foram fixadas, coradas para vinculina e actina, e fotografada pela epifluorescência. Embora Sdc4 – / – fibroblastos foram fibronectina insensível, ultra-som ainda induziram a formação da adesão focal, indicando que o ultrassom ignora engajamento receptor matriz. Barra = 10 uM. Figura 5. Ativação de Rac1 por ultra-som. As células foram estimuladas durante 0, 10, 30 e 60 minutos, com 6 poços utilizados por ponto de tempo. A quantidade de GTP-Rac1 presentes em amostras de um curso de tempo Rac1 pull-down ensaio foi visualizada por incubação com anticorpo anti-Rac1 sobre uma western blot (imagem de cima). Quantificação da intensidade da banda (média de 8-10 repetições) revela aumento Rac1 umctividades resultante a partir do sinal de ultra-som com 10 e 30 minutos, antes de retornar para níveis basais de 60 minutos (gráfico). As barras de erro representam SEM