ניתוח כמותי כושר (QFA) היא סדרה משלימה של שיטות ניסיוניות חישובית לאומדן fitnesses התרבות חיידקים. QFA מעריך את ההשפעה של מוטציות גנטיות, תרופות או טיפולים אחרים החלים על הצמיחה חיידק. ניסויים דרוג מניתוח מרוכז של תרבויות בודדות לאלפי תרבויות מקבילות יכול להיות מתוכנן.
ניתוח כמותי כושר (QFA) היא עבודה ניסיונית חישובית להשוואת fitnesses של תרבויות חיידקים הגדלים 1,2,3,4 במקביל. QFA יכול להיות מיושם על תצפיות ממוקד של תרבויות בודדים אך הוא שימושי ביותר עבור אינטראקציה הגנום כולו גנטית או מסכי סמים לחקור עד אלפי תרבויות בלתי תלויים. שיטת הניסוי המרכזי הוא חיסון של עצמאיים, תרבויות לדלל חיידקים נוזלי על גבי צלחות אגר מוצק אשר מודגרת וצילם באופן קבוע. צילומים מנקודת זמן זו מנותחים, ייצור כמותי צפיפות התאים הערכות, המשמשים לבניית עקומות גדילה, המאפשר כושר צעדים כמותיים שניתן להפיק. Fitnesses תרבות אפשר להשוות לכמת ולדרג את נקודות החוזק אינטראקציה גנטיים או רגישויות סמים. ההשפעה על כושר התרבות של טיפולים כלשהם הוסיף לתוך המצע אגר (מולקולות קטנות כגון אנטיביוטיקה או תזונה) או להחיל את לוחות חיצוניתLY (UV למשל קרינה, טמפרטורה) ניתן לכמת ידי QFA.
עבודה QFA מייצרת צמיחה מעריך מקביל לאלה שהושגו על ידי מדידת spectrophotometric של תרבויות נוזלי מקבילים קוראים צלחת 96-200-טוב או טוב. חשוב לציין, QFA יש תפוקה גבוהה באופן משמעותי בהשוואה לשיטות כאלה. תרבויות QFA לגדול על פני אגר מוצק ולכן הם מאוורר היטב במהלך הצמיחה ללא צורך לערבב או רועד.
התפוקה QFA אינו גבוה כמו זה של מערך גנטי כלשהו סינתטי (SGA) שיטות ההקרנה 5,6. עם זאת, מאז תרבויות QFA הם בדילול בכבדות לפני מחוסן על אגר, QFA יכול ללכוד עקומות גדילה שלם יותר, לרבות מעריכי שלבי הרוויה 3. כך, למשל, עקומת גדילה תצפיות לאפשר הכפלת פעמים תרבות כדי לאמוד באופן ישיר עם דיוק גבוהה, כפי שצוין קודם לכן 1.
כאן אנו מציגיםספציפית QFA הפרוטוקול מיושם על אלפי ש ' cerevisiae תרבויות אשר טיפל באופן אוטומטי במהלך הדגירה חיסון, והדמיה על ידי רובוטים. כל הפעולות האוטומטיות יכול להיות מוחלף על ידי ההליך, שווה ערך ידנית, עם ירידה קשור התפוקה, ויש לנו גם להציג ידנית נמוך פרוטוקול התפוקה. הכלים אותם QFA התוכנה ניתן להחיל על תמונות שנתפסו בזרימת העבודה או.
יש לנו ניסיון רב ביישום QFA לתרבויות של שמרים ניצני ס cerevisiae אך אנו צופים כי QFA יהיה שימושי באותה מידה לבחינת תרבויות של שמרים ביקוע ס pombe ותרבויות חיידקים.
QFA הוא במובנים רבים ישירה צאצא של שלושה הספסל בקנה מידה שנקבעו טכניקות מיקרוביולוגיות: דילול תרבות ספוט סדרת בדיקות 9, עקומת גדילה נחישות תרבויות נוזל סודה 9 ו 13 ציפוי העתק. שלוש שיטות אלו מסוכמים ולעומת QFA אחרים תפוקה גבוהה טכניקות בטבלה 2. בעוד סדרת בדיקות דילול ספוט להגדיר הכושר של זן כפי יכולתו ליצור מושבות בסדרה של התרבויות שצמחו מתוך מגוון רחב של דילולים הבידוד, QFA אמצעים כושר זן ידי תצפיות חוזרות ונשנות של תרבות אחת על מנת לבנות עקומת גדילה. לכימות כושר מתרבויות יחיד מאפשר זנים רבים יותר כדי לבחון בעת ובעונה אחת, בתנאים זהים. מערכים משכפלים של תרבויות מאפשר בדיקות חוזרות ונשנות של אוספים מתח, המועילה ביותר כאשר בודקים כושר הבדלים תרבות בסביבות שונות או רקע גנטי. פרוטוקול QFA הציגכאן משתמשת בציוד רובוטי יקר לשכפל, מחסן, לדגור צלחות אגר התמונה, המתאים לצפייה הצמיחה של אלפי תרבויות עצמאיות (QFA רובוטית, לוח 2). עם זאת, מאז QFA מבוסס על טכניקות מסורתיות מבוססות המעבדה, זה גם יכול להתבצע הרבה יותר בזול על ידי החלפת סיוע רובוט בצעדים ידנית (ידנית QFA, טבלה 2). מדריך QFA כרוך שכפול חיסון של תרבויות על גבי צלחות אגר באמצעות כלי סיכה ידני העברת ידנית של צלחות וממנה חממה לצילום. העבודה באותו ניתוח חישובית ניתן ליישם כדי ליצור עקומות גדילה של עיצוב או ניסיוני.
QFA הערכות כושר נראה מדויק יחסית. באיור 4, fitnesses הממוצע של ארבעה אשכולות לדוגמה תפקודית של מחיקות גנים הקשורים מודגשים. בסמיכות של בני המעמד גן פונקציונלי כל הקשור independ 2אף אוזן גרון רקע גנטי (ura3Δ ו cdc13-1) מציין את שחזור של הערכות QFA כושר. למשל, רק 3 מחיקות גנים (מתוך 4300 אפשרי) להפריד בין שלושה מבני מורכב MRX משומר.
תפוקה גבוהה חלופות QFA לבדיקת מאפייני הגידול של זני חיידקים כוללים SGA 5,6, מסכי התחרות בספריות המינימרקטים 11,12 ומסכי לכידת קינטיקה צפיפות אופטית של הקוראים צלחת spectrophotometric 10 אשר סיכם בטבלה 2 ותיאר באופן מלא יותר במקום אחר 8 . QFA וצלחות SGA, שבו תרבויות הגדלים על משטחים מוצקים אגר (שיטות המבוססות על אגר, טבלה 2) ניתן לטפל בקלות ובמהירות על ידי רובוט. מוצקים פני תרבויות אגר הם מאוורר היטב ברחבי צמיחה התאים יכולים לגדול בתרבויות קבועים, ומאפשר חיידקים חברותיים לגדול בקהילה 14. נותר בשלמותו, קהילות מיקרוביאלי כמהffect שלהם מיקרו סביבות הפרשת רעלים, כמו אתנול, ואולי איתות בין תאים. עם זאת, ערבוב רציף של תרבויות נוזלי, הדרושים כדי להשיג אוורור הולם, משבש באופן מלאכותי קהילות מיקרוביאלי וסביבות מיקרו שלהם אשר עשוי להשפיע על מצבי שלהם של צמיחה. חוצה זיהום הוא פחות דאגה בשיטות אגר מוצק שכן יש פחות הזדמנויות עבור כתמים נוזליים שנשאו תאים בין תרבויות. אם הזיהום מתרחש בדרך האוויר שמקורן בחיידקים זרים מבחני אגר מוצק, היא לעתים קרובות ניתן להבחין באמצעות בדיקה ויזואלית של צלחות אגר מוצק היוו או להסירו.
התפוקה QFA גבוה באופן משמעותי מזה של שיטות נוזלי מקבילים בשתי דרכים. קודם כל, על QFA (ו SGA) צלחות, תרבויות מחוסן ארוזים יחד יותר בצפיפות, נותן תרבויות עצמאיות יותר בכל צלחת. ב QFA יש בדרך כלל 308 תרבויות, לא כולל הלא ניסיוניים תרבויות מתקדמות (איור 1) comבשורה התחתונה, שטיין במקביל בתרבויות נוזלי עם 96 או 100 תרבויות בכל צלחת. שנית, ניסויים QFA וניתן לשנותם למספר הרבה יותר גדול של צלחות. בעוד מספר הצלחות ניתח בניסוי QFA אחת מוגבל רק על ידי השטח הזמין בחדר חממה או חם, לכידת המינימום המותר בתדירות התמונה בתדירות מקסימלית לכידת השגה, מספר הצלחות בניסוי גידול נוזלי הוא מוגבל מאוד לפי נפח את הקורא הצלחת (בדרך כלל אחת או שתיים הצלחות), או של מערם מחובר הקורא את הצלחת (בדרך כלל 25-50 לוחיות). ביצענו לאחרונה את הניסוי אוטומטי לחלוטין QFA על 123 צלחות, כל אחד עם 308 בתרבויות ניסיוניות, נותן 37,884 תרבויות בו זמנית. אנו מעריכים כי המספר המרבי של השגה תרבויות עצמאיות הגדלים נוזלי היא 96 (תרבויות / צלחת) x 50 (צלחות / מערם) = 4800, שזה בערך פי 10 פחות מאשר התפוקה QFA שלנו. אלטרנטיבי מסכי תרבות נוזלי הוא לנצל רבים אוטומטי Groמכשירים wth במקביל (טבלה 1 מביקורת על ידי Blomberg 8), כל אחד בעל קיבולת של אחד או 2 צלחות. בקרת הטמפרטורה במכשיר זה הוא עצמאי, ולכן התנאים אינם זהים, אבל בהנחה שהם, זרימת עבודה זו תדרוש לפחות 190 מכשירים כאלה כדי להתאים את התפוקה QFA (בהנחה 200 תרבויות נוזלי לכל מכשיר).
לסיכום, QFA היא עבודה באיכות גבוהה שניתן להחיל מועילה לאסוף פנוטיפים צמיחה כמותיים בשני ניסויים קטנים ממוקד לגודל תפוקה גבוהה מסכים. היא גמישה מספיק כדי ליישם ביעילות עם דרישות שונות עבור ציוד רובוטי. מרכיב חישובית של זרימת העבודה QFA מבוסס על הקוד, זמין בחינם קוד פתוח.
The authors have nothing to disclose.
אנו בתודה להכיר את כל חברי המעבדה שלנו המרכז לביולוגיה מערכת משולבת של הזדקנות ותזונה (CISBAN) עבור תמיכה דיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC) (BB/C008200/1) ואת האמון Wellcome (075294, 093088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.