Quantitative Analyse Fitness (QFA) ist eine ergänzende Reihe von experimentellen und rechnerischen Methoden zur Schätzung der mikrobiellen Kultur Fitnesswerte. QFA schätzt den Effekt genetischer Mutationen, Medikamente oder andere Behandlungen angewandt auf Mikrobenwachstum. Experimente Skalierung von fokussierten Analyse der einzelnen Kulturen zu Tausenden von parallelen Kulturen ausgelegt werden kann.
Quantitative Analyse Fitness (QFA) ist ein experimenteller und rechnerischer Workflow für den Vergleich von Fitness der mikrobiellen Kulturen parallel 1,2,3,4 gewachsen. QFA können fokussierten Beobachtungen der einzelnen Kulturen angewandt werden, sondern ist sehr nützlich für genomweite genetische Interaktion oder Drogen-Bildschirme der Untersuchung bis zu Tausenden von unabhängigen Kulturen. Die zentrale experimentelle Methode ist die Impfung von unabhängigen, verdünnte Flüssigkeit mikrobiellen Kulturen auf festen Agar-Platten, die bebrütet und werden regelmäßig fotografiert. Fotos von jedem Zeit-Punkt analysiert, Erstellung von quantitativen Zelldichte Schätzungen, die verwendet werden, um Wachstumskurven zu konstruieren, so dass quantitative Fitness-Maßnahmen abgeleitet werden. Kultur Fitnesswerte kann im Vergleich zu quantifizieren und zu zählen genetische Interaktion Stärken oder Drogen-Empfindlichkeiten werden. Die Auswirkungen auf die Kultur von den Behandlungen Fitness Hinzugefuegt in Substrat-Agar (z. B. kleine Moleküle, Antibiotika oder Nährstoffe) oder aufgebracht auf externen Plattenly (zB UV-Einstrahlung, Temperatur) kann durch QFA quantifiziert werden.
Die QFA Workflow erzeugt Wachstum schätzt analog zu den durch spektrophotometrische Messung der parallelen flüssigen Kulturen in 96-Well oder 200-Well-Platte Software erhalten. Wichtig ist, daß QFA deutlich höheren Durchsatz im Vergleich mit solchen Methoden. QFA Kulturen wachsen auf einem festen Agar-Oberfläche und werden daher auch während des Wachstums ohne Rühren oder Schütteln belüftet.
QFA Durchsatz ist nicht so hoch wie die einiger synthetischer Genetic Array (SGA) Screening-Verfahren 5,6. Da jedoch QFA Kulturen stark, bevor sie auf Agar geimpft verdünnt werden, können QFA erfassen vollständigere Wachstumskurven, einschließlich Exponential-und Sättigungs-Phasen 3. Zum Beispiel ermöglichen Wachstumskurve Beobachtungen Kultur Verdoppelungszeiten direkt mit hoher Genauigkeit geschätzt werden, wie zuvor diskutiert 1.
Hier präsentieren wir einspezifische QFA-Protokoll angewandt, um Tausende von S. cerevisiae Kulturen, die automatisch durch Roboter sind während der Inokulation, Inkubation und Imaging behandelt. Jeder dieser Schritte kann automatisiert durch ein gleichwertiges, manuelle Verfahren ersetzt werden, mit einer zugehörigen Reduzierung der Durchlaufzeit, und wir präsentieren auch einen geringeren Durchsatz manuelle Protokoll. Die gleichen QFA Software-Tools, um Bilder in entweder Workflow erfasst angewendet werden.
Wir haben umfangreiche Erfahrungen auf die Anwendung QFA Kulturen der Bäckerhefe S. cerevisiae, aber wir erwarten, dass QFA erweisen wird ebenso nützlich für die Prüfung Kulturen der Spalthefe S. pombe und Bakterienkulturen.
QFA ist in vielerlei Hinsicht ein direkter Nachkomme von drei etablierten Labormaßstab mikrobiologischen Techniken: Kultur Verdünnungsreihe Stichproben 9, Wachstumskurve Bestimmung in belüfteten Flüssigkulturen 9 und 13 Replica-Plating. Diese drei Methoden werden zusammengefasst und verglichen mit QFA und andere High-Throughput-Techniken, die in Tabelle 2. Während Verdünnungsreihe Stichproben definieren, einem Stamm der Fitness als seine Fähigkeit, Kolonien in einer Reihe von Kulturen aus einer Reihe von Verdünnungen Inokulum gewachsen zu bilden, um QFA Maßnahmen Belastung Fitness durch wiederholte Beobachtungen einer einzigen Kultur konstruieren eine Wachstumskurve. Die Quantifizierung der Fitness von einzelnen Kulturen ermöglicht viele weitere Stämme gleichzeitig untersucht werden, unter identischen Bedingungen. Replizieren von Arrays der Kulturen ermöglicht wiederholtes Testen von Stammsammlungen, am sinnvollsten bei der Prüfung für Kultur Fitness Unterschiede in verschiedenen Umgebungen oder genetischen Hintergründen. Die QFA Protokoll vorgestellthier verwendet teure Roboter-Anlagen zu replizieren, beimpfen, inkubieren und Bild-Agar-Platten, geeignet für die Beobachtung Wachstum von Tausenden von unabhängigen Kulturen (Roboter QFA, Tabelle 2). Da jedoch QFA auf etablierten, traditionellen Labor-Techniken basiert, kann es auch viel billiger werden durch das Ersetzen Roboter mit Hilfe manueller Schritte (manuelle QFA, Tabelle 2) durchgeführt. Manuelle QFA beinhaltet Replikation und Inokulation der Kulturen auf Agarplatten mit einem manuellen Stiftwerkzeug und der manuellen Übertragung von Platten zu und von einem Inkubator für Fotografie. Das gleiche rechnerische Analyse Workflow angewendet werden, um Wachstumskurven von beiden experimentellen Design zu generieren.
QFA Fitness Schätzungen zu sein scheinen vergleichsweise präzise. In Abbildung 4 sind die mittlere Fitness der vier Beispiel-Cluster von funktionell verwandten Gen-Deletionen hervorgehoben. Die räumliche Nähe der Mitglieder jeder funktionell verwandten Gen-Klasse in zwei unabhängigeHNO genetischen Hintergründen (ura3Δ und CDC13-1) zeigt die Reproduzierbarkeit der QFA Fitness-Schätzungen. Zum Beispiel, trennen nur 3 Gendeletionen (von möglichen 4300) die drei Mitglieder der konservierten MRX-Komplex.
High-Throughput-Alternativen zu QFA zum Testen Wachstumseigenschaften mikrobielle Stämme umfassen SGA 5,6, Wettbewerb Bildschirme in Strichcode-Bibliotheken 11,12 und Bildschirme aufnehmenden optischen Dichte Kinetik spektrophotometrische Plattenleser 10, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, und an anderer Stelle ausführlicher beschrieben 8 . QFA und SGA-Platten, wo Kulturen wachsen auf Agar-Oberflächen (Agar-basierten Methoden, Tabelle 2) können schnell und einfach per Roboter behandelt werden. Solide Agaroberfläche Kulturen sind gut belüftet und das Wachstum im gesamten Zellen können in festen Kulturen wachsen, so gesellig Mikroben in einer Gemeinschaft zu 14 wachsen. Intakt gelassen, mikrobieller Gemeinschaften einUSWIRKUNG eigenen Mikroumgebung, sezernierenden Toxine, wie Ethanol, und möglicherweise Signalisierung zwischen Zellen. Allerdings kontinuierliches Mischen von flüssigen Kulturen, notwendig, um ausreichende Belüftung zu erreichen, künstlich stört mikrobieller Gemeinschaften und deren Mikro-Umgebungen, die ihre Funktionsweise Wachstum beeinträchtigen können. Cross-Kontamination ist weniger ein Problem in festen Agar-Methoden, da es weniger Gelegenheit für Flüssigkeitsspritzern tragenden Zellen zwischen den Kulturen. Wenn Kontamination durch fremde luftgetragenen Mikroben in festen Agar-Assays, kann es oft durch visuelle Inspektion von festen Agar-Platten erkannt werden und machten oder entfernt werden.
QFA Durchsatz erheblich höher als die der Flüssigkeit parallel Verfahren auf zwei Arten. Zunächst auf QFA (und SGA)-Platten, inokuliert Kulturen zusammen dichter gepackt, so dass mehrere unabhängige Kulturen pro Platte. In QFA gibt es typischerweise 308 Kulturen, nicht mitgerechnet nicht-experimentellen Rand Kulturen (Abbildung 1) comVergleich zu flüssigen Kulturen mit 96 oder 100 Kulturen pro Platte parallel. Zweitens kann QFA Versuche zu einer viel größeren Anzahl von Platten skaliert werden. Während die Anzahl der Platten in einem einzigen Experiment analysiert QFA nur durch den verfügbaren Raum in einem Inkubator oder warmen Raum, der minimal zulässige Bilderfassungsvorrichtung Frequenz und der maximal erreichbaren Capture Frequenz beschränkt ist, ist die Anzahl von Platten in einem flüssigen Wachstumsmedium Experiment stark eingeschränkt durch die Kapazität der Platten-Lesegerät (typischerweise ein oder zwei Platten) oder der Ablage an der Platten-Lesegerät (typischer Wert von 25-50 Platten). Wir haben vor kurzem eine vollautomatische QFA Experiment auf 123 Platten mit je 308 experimentellen Kulturen durchgeführt, so dass 37.884 gleichzeitigen Kulturen. Wir schätzen, dass die maximal erreichbare Anzahl von unabhängigen Kulturen wachsen in flüssiger 96 (Kulturen / Platte) ist x 50 (Platten / Stapler) = 4800, die um das Zehnfache kleiner als unsere QFA Durchsatz ist. Eine Alternative für flüssige Kultur-Bildschirme ist für viele automatisierte gro nutzenwth Geräte parallel (Tabelle 1 aus der Bewertung von Blomberg 8), jede mit einer Kapazität von einem oder zwei Platten. Temperaturregelung in jedem Gerät ist unabhängig, und so Bedingungen sind nicht identisch, aber davon aus, dass sie sind, würde dies Workflow benötigen mindestens 190 solcher Geräte zu QFA Durchsatz (unter der Annahme 200 Flüssigkulturen pro Gerät) entsprechen.
Zusammenfassend ist QFA eine hochwertige Workflow, sinnvoll angewendet werden kann, um quantitatives Wachstum Phänotypen in beiden Kleinen fokussiert Experimente und High-Throughput-Screens sammeln. Es ist flexibel genug, um effektiv mit unterschiedlichen Anforderungen an die Roboter-Anlagen angewendet werden. Die rechnerische Komponente der QFA Workflow basiert auf frei verfügbarer Open-Source-Code basiert.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors und dem Zentrum für Integrierte System-Biologie des Alterns und Ernährung (CISBAN) für die Unterstützung und hilfreiche Diskussionen. Diese Studie wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) und des Wellcome Trust (075294, 093088) unterstützt.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.