Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten
Summary
Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een gebruik<em> In vitro</em> Of<em> In vivo</em> Inductie-systeem, iPS cellen zijn in staat om te differentiëren in zowel conventionele als antigeen-specifieke T-lymfocyten.
Abstract
Adoptieve overdracht cel (ACT) van antigeen-specifieke CD8 + cytotoxische T lymfocyten (CTL) is een veelbelovende behandeling voor een verscheidenheid van tumoren 1. CTL's kan herkennen kwaadaardige cellen door interactie tumor antigenen met de T-cel-receptoren (TCR), en laat cytotoxinen en cytokines om kwaadaardige cellen te doden. Het is bekend dat minder gedifferentieerd en centrale geheugen zoals (zogenoemde zeer reactieve) CTL's de optimale populatie ACT gebaseerde immunotherapie omdat deze CTL een hoge proliferatie potentieel minder gevoelig voor apoptose dan meer gedifferentieerde cellen en een hogere vermogen om te reageren op homeostatische cytokinen 2-7. Echter, vanwege problemen bij het verkrijgen van een groot aantal van zulke CTL's van patiënten, is er een dringende behoefte aan een nieuwe aanpak van de zeer reactieve Ag-specifieke CTL's voor een succesvolle ACT-gebaseerde therapieën te genereren te vinden.
TCR transductie van de zelf-hernieuwbare stamcellen Immuun een therapeutisch potentieel voor de behandeling van ziekten 8-10. Echter, de aanpak van embryonale stamcellen (SER) te verkrijgen van de patiënten is niet haalbaar. Hoewel het gebruik van hematopoietische stamcellen (HSC) voor therapeutische doeleinden is op grote schaal toegepast in de kliniek 11-13 zijn HSCs minder differentiatie en proliferatieve capaciteiten en HSCs moeilijk in te breiden in vitro celkweek 14-16. Recente iPS cel-technologie en de ontwikkeling van een in vitro systeem voor gen delivery in staat zijn om het genereren van iPS cellen van patiënten zonder chirurgische benadering. Bovendien, zoals SER, iPS cellen hebben onbepaalde prolifereren in vitro, en blijken te differentiëren in hematopoïetische cellen. Zo iPS cellen groter potentieel worden gebruikt in ACT gebaseerde immunotherapie opzichte SER of HSCs.
Hier we methode voor het genereren van T lymfocytencyten van iPS cellen in vitro en in vivo programmering van antigeen-specifieke CTL's van IPS cellen te bevorderen kanker immuunsurveillance. Stimulatie in vitro met een inkeping ligand aandrijft T celdifferentiatie van iPS cellen en TCR gen transductie resultaten iPS cellen differentiëren in antigeen-specifieke T-cellen in vivo, die tumorgroei voorkomt. Zo tonen we aan antigeen-specifieke T-cel differentiatie van IPS-cellen. Onze studies bieden een potentieel efficiëntere aanpak voor het genereren van antigeen-specifieke CTL's voor ACT-based therapieën en de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor ziekten.
Protocol
Discussion
Voor ACT-therapieën, de in vitro productie van grote aantallen zeer reactieve Ag T-cellen in vivo opnieuw infusie een optimale benadering. Hoewel wij in vitro methode leidt functionele T-cellen uit iPS cellen grote aantallen iPS cel afkomstige afsterven vier weken, vooral in de vierde week. We concluderen dat het voortbestaan signalen van Notch signalering door bemiddeling van de DL1 en IL-7 en FLt3L niet voldoende zijn om het voortbestaan van iPS cel afkomstige progenitor T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Shinya Yamanaka (Kyoto University) voor het leveren van iPS-MEF-Ng-20D-17 cellijn, Dr Dario Vignali (St. Jude Children's Research Hospital) voor het ondersteunen van de OT1-2A • pMig II constructie, dr. Juan carlos Zuniga-Pflucker (afdeling Immunologie van de Universiteit van Toronto) voor het ondersteunen van de OP9-DL1 cellijn, en Dr Kent E Vrana (Vakgroep Farmacologie, Penn State University College of Medicine) voor het helpen van het ontwerp van deze studie. Dit project wordt gefinancierd op grond van subsidies met het licentienummer K18CA151798 van het National Cancer Institute, de Barsumian Trust en de Melanoma Research Foundation (J. Song).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 |
| B6.129S7-Rag1tm1Mom/J | Jackson Laboratory | 002216 |
| Anti-CD3 (2C11) antibody | BD PharMingen | 553058 |
| Anti-CD28 (37.51) antibody | BD PharMingen | 553295 |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | BioLegend | 100202 |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | BioLegend | 100417 |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | BioLegend | 100714 |
| Anti-CD25 (3C7) antibody | BioLegend | 101912 |
| Anti-CD44 (1M7) antibody | BioLegend | 103012 |
| Anti-CD117 (2B8) antibody | BioLegend | 105812 |
| Anti-TCR-β (H57597) antibody | BioLegend | 109220 |
| Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody | BioLegend | 503810 |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | BioLegend | 505822 |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 |
| FBS | HyClone | SH3007.01 |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 |
| Polybrene | Sigma | 107689 |
| GeneJammer | Integrated Sciences | 204130 |
| RNA kit | Qiagen | 74104 |
| DNA kit | Qiagen | 69504 |
| CD8 Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-236 |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E |
| mFlt-3L | PeproTech | 250-31L |
| mIL-7 | PeproTech | 217-17 |
| Gelatin | Sigma | G9391 |
| FITC-anti-OVA antibody | Rockland Immunochemicals | 200-4233 |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 |
| 0.4 μm filter | MIllipore | |
| Moflo Cell Sorter | Dake Cytomation | |
| Calibur Flow Cytometer | BD | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific |
References
- Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
- Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
- Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
- Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
- Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
- Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
- Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
- Boztug, K., Med, N. .. E. n. g. l. .. J. .. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
- Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
- Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
- Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
- Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
- Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).
