Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme
Summary
NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) 'dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.
Abstract
NADPH oksidaz antibakteriyel ve antifungal konak savunma aracılık kritik bir enzimdir. Antimikrobiyal konak savunma rolüne ek olarak, NADPH oksidaz inflamatuvar yanıt 1 modüle kritik sinyalizasyon fonksiyonları vardır. Böylece, NADPH oksidaz kökenli ROS nesil "gerçek zamanlı" kinetik ölçmek için bir yöntem geliştirilmesi savunma, inflamasyon ve yaralanma barındırması ilgili mekanizmalar anlamak için değerli bir araştırma aracı olması bekleniyor.
Kronik granülomatöz hastalık (CGD) ciddi enfeksiyonlar ve aşırı inflamasyon ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır. Fagosit NADPH oksidaz aktivasyonu, kendi sitosolik alt birimden (S47 phox, phox P67, P40 ve phox) ve bir membran-sınırlayıcı flavocytochrome (bir gp91 phox ve p22 heterodimeri phox oluşur) Rac translokasyon gerektirir. KayıpCGD bu NADPH oksidaz bileşenlerin sonucu herhangi birinde işlev mutasyonlar. ÇGD olan hastalarda benzer, gp91 phox-eksik farelerde ve S47 phox-eksik farelerde arızalı fagosit NADPH oksidaz aktivitesi ve bozulmuş konak savunması 13, 14 var. Yukarıda tarif edilen NADPH oksidaz bileşenler içeren fagositler, ek olarak, diğer hücre tipleri arasında, çeşitli NADPH oksidaz izoformları değişik ifade eder.
Burada yaşayan farelerde ROS üretimini ölçmek ve inflamasyon ve yaralanma modellerinde ROS nesil NADPH oksidaz katkısını belirginleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir şarj bağlı cihaz (CCD) tarafından kaydedilir ışıldama yayma L-012 (luminol bir analog) ile reaksiyona ROS dayanmaktadır. L-012 prob orijinal tanımı olarak, L-012-bağlı kemiluminesans tamamen bu reaksiyon tespit ana ROS süper olduğunu gösteren, süperoksit dismutaz kaldırılmış;oksit anyon 15. Daha sonraki çalışmalar, L-012 reaktif nitrojen türleri 16, 17 gibi diğer serbest radikaller, tespit edebildiğini göstermiştir. Kielland ve ark. 17 forbol miristat asetat, NADPH oksidaz güçlü bir aktivatörü, bu topikal uygulama ışıldayan sonda L-012 fare kullanılarak tespit edilebilir oksidaz bağımlı ROS NADPH üretim yol göstermiştir. Bu modelde, L-012-bağımlı lüminesans S47 phox-eksik farelerde kaldırılmış olduğunu gösterdi.
Biz yabani-tip farelerden ve NADPH oksidaz eksikliği S47 phox-/ ROS üretimi karşılaştınl – aşağıdaki üç model fareler 2: zymosan, NADPH oksidaz aktive edebilirsiniz duvara türetilmiş ürün pro-inflamatuar fungal hücre 1) zerk; 2) çekal ligasyon ve delme (CLP), sekonder akut akciğer inflamasyonu ve hasarı ile intra-abdominal sepsis modeli ve 3) sözlü karbon tetraklorür(CCl4), ROS-bağımlı karaciğer hasarının bir model. Bu modeller özellikle sırasıyla, non-enfeksiyöz inflamasyon, polimikrobiyal sepsis ve toksin kaynaklı organ hasarının bağlamında NADPH oksidaz bağımlı ROS üretimi değerlendirmek için seçilmiştir. S47 için yabani-tip farelerde biyolüminesans karşılaştırma phox-/ – farelerde bize bu modellerde bioluminescent sinyal S47 phox içeren NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS özgül katkıda tasvir sağlar.
S47 ile karşılaştırıldığında yabani-tip farelerden artmış ROS seviyeleri gösterdi Biyoparlaklık görüntüleme sonuçları phox-/ – farelerde NADPH oksidaz enflamatuvar uyaranlara yanıt olarak ROS üretiminin ana kaynağı olduğunu belirtti. Bu yöntem, in vivo enflamasyon sırasında ROS nesil "gerçek zamanlı" izlenmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sağlar.
Protocol
Discussion
Canlı hayvanlar reaktif oksijen türlerinin "Gerçek zamanlı" ölçümü (ROS) floresan ve kemilüminesans problar kullanılarak elde edilebilir. Floresan problar zayıf sinyal-gürültü oranı 12 olan muzdarip iken, açıklanan görüntüleme tekniği luminol tabanlı substrat L-012 ile ROS bir kimyasal reaksiyon sonrasında ışık emisyon tespiti için daha duyarlıdır. Tüm bioluminescent görüntüleme teknikleri gibi, bu metodoloji organ ve dokular tarafından dalgaboyu bağımlı ışık …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH RO1 AI079253 ve Gazi İşleri Bakanlığı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 .
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y, ., Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
