Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

NADPH oxidase is een essentieel enzym dat antibacteriële en antifungale afweer medieert. Naast zijn rol in antimicrobiële afweer, NADPH oxidase verregaande signaalfuncties dat de ontstekingsreactie ¹ moduleren. Aldus wordt de ontwikkeling van een meetmethode in "real-time" de kinetiek van NADPH oxidase afgeleide ROS productie verwacht een waardevol onderzoeksinstrument mechanismen relevant defensie, ontsteking en schade gastheer begrijpen.

Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het NADPH oxidase gekenmerkt door ernstige infecties en overmatige ontsteking. Activering van de fagocyt NADPH oxidase heeft translocatie van de cytosolische subeenheden (p47 ^phox, p67 ^phox en p40 ^phox) en Rac een membraangebonden flavocytochrome (bestaande uit een Gp91 ^phox en p22 heterodimeer ^phox). Verliesvan functie mutaties in een van deze NADPH oxidase componenten resulteren in CGD. Vergelijkbaar met patiënten met CGD, Gp91 ^phox deficiënte muizen en p47 ^phox deficiënte muizen defect fagocyt NADPH oxidase activiteit en verminderde afweer ^{13, 14.} Naast fagocyten die de NADPH oxidase bovenbeschreven componenten bevatten, een verscheidenheid aan andere celtypen expressie verschillende isovormen van NADPH oxidase.

Hier beschrijven we een werkwijze voor ROS productie kwantificeren levende muizen en de bijdrage van NADPH oxidase van ROS productie in modellen voor ontsteking en schade bakenen. Deze methode is gebaseerd op ROS reactie met L-012 (een analoog van luminol) om luminescentie die wordt geregistreerd door een charge-coupled device (CCD) uitstoten. In de oorspronkelijke beschrijving van de L-012 probe, werd L-012-afhankelijke chemiluminescentie afgeschaft door superoxide dismutase, wat aangeeft dat de voornaamste ROS gedetecteerd in deze reactie was superoxide anion ^15. Latere studies hebben aangetoond dat L-012 kunnen andere vrije radicalen, inclusief reactieve stikstofverbindingen ^{16, 17} detecteren. Kielland et al. ^17. Aangetoond dat topicale toediening van forbolmyristaatacetaat, een potente activator van NADPH oxidase, tot oxidase-afhankelijke ROS generatie die kon worden gedetecteerd in muizen met de luminescerende probe L-012 NADPH. In dit model toonden ze aan dat L-012-afhankelijke luminescentie werd afgeschaft ^phox p47 deficiënte muizen.

We vergeleken ROS productie in wildtype muizen en NADPH oxidase-deficiënte p47 ^{phox / –} muizen ² in de volgende drie modellen: 1) intratracheale toediening van zymosan, een pro-inflammatoire schimmelcelwand afgeleid product dat NADPH oxidase kan activeren, 2) cecal ligatie en punctie (CLP), een model van intra-abdominale sepsis met secundaire acute longontsteking en de schade, en 3) orale tetrachloorkoolstof(CCl _4), een model van ROS-afhankelijke leverschade. Deze modellen zijn speciaal geselecteerd om NADPH oxidase-afhankelijke ROS productie evalueren in de context van niet-infectieuze ontsteking, sepsis polymicrobiële en toxine-geïnduceerde orgaanschade respectievelijk. Vergelijking bioluminescentie in wildtype muizen p47 ^{phox / –} muizen kunnen we bakenen de specifieke bijdrage van ROS gegenereerd door p47 ^phox bevattende NADPH oxidase de bioluminescent signaal in deze modellen.

Bioluminescentie resultaten die verhoogde niveaus ROS in wildtype muizen aangetoond vergeleken met p47 ^{phox / –} muizen aan dat NADPH oxidase is de belangrijkste bron van ROS productie in reactie op inflammatoire stimuli. Deze methode biedt een minimaal invasieve benadering voor "real-time" monitoring van ROS generatie tijdens ontsteking in vivo.