Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen
Summary
Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.
Abstract
In de afgelopen tien jaar heeft stamceltransplantatie kreeg steeds meer interesse als primaire of secundaire therapeutische modaliteit voor een verscheidenheid van ziekten, zowel in de preklinische en klinische studies. Echter, tot op heden de resultaten met betrekking tot functioneel resultaat en / of weefsel regeneratie volgende stamceltransplantatie zijn zeer divers. Over het algemeen wordt een klinisch voordeel waargenomen, zonder diepgaande kennis van het onderliggende mechanisme (s) 1. Daarom hebben meerdere inspanningen geleid tot de ontwikkeling van verschillende moleculaire beeldvormende technieken om stamcellen enten met het uiteindelijke doel om nauwkeurig te evalueren overleven, het lot en de fysiologie van geënte stamcellen en / of hun micro-omgeving te bewaken. Veranderingen waargenomen in een of meer parameters bepaald door moleculaire beeldvorming kan worden gerelateerd aan de waargenomen klinisch effect. In deze context, onze studies richten zich op het gecombineerd gebruik van bioluminescentie (BLI), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en histologische analysis om stamcel transplantatie te beoordelen.
BLI wordt vaak gebruikt om niet-invasief te voeren cel volgen en te controleren overleving van de cel in de tijd na de transplantatie 2-7, op basis van een biochemische reactie waarbij cellen die de Luciferase-reporter-gen in staat zijn om licht volgende interactie uit te stoten met zijn substraat (bijv. D- luciferine) 8, 9. MRI anderzijds een niet-invasieve techniek die klinisch toepassing 10 en kan worden gebruikt om nauwkeurig cellulaire grafts lokaliseren met zeer hoge resolutie 11-15 hoewel de gevoeligheid sterk afhankelijk van het contrast gegenereerd na labeling cel met een MRI contrastmiddel . Tot slot, post-mortem histologische analyse is de methode bij uitstek om onderzoeksresultaten verkregen met niet-invasieve technieken met de hoogste resolutie en gevoeligheid te valideren. Bovendien eindpunt histologische analyse laat ons toe om uit te voeren gedetailleerde fenotypische analyse van geënte cellen en / of het omliggende weefsel, based op het gebruik van fluorescerende reporter eiwitten en / of direct cel labeling met specifieke antilichamen.
Samenvattend kunnen we hier visueel tonen de complementariteit van BLI, MRI en histologie aan verschillende stamcel-en / of milieu-gerelateerde kenmerken na stamcel transplantatie in het CZS van muizen te ontrafelen. Als voorbeeld beenmerg-afgeleide stromacellen, genetisch gemanipuleerd om de versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) en vuurvlieg luciferase (fluctuaties), en voorzien van blauw fluorescerende microscopisch kleine ijzeroxide deeltjes (MPIOs) drukken, worden geënt in de CNS van immuun-competente muizen en het resultaat zal worden gecontroleerd door BLI, MRI en histologie (figuur 1).
Protocol
Discussion
In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor de combinatie van drie elkaar aanvullende beeldvormende technieken (BLI, MRI en histologie) voor gedetailleerde karakterisering van cellulaire implantaten in het CZS van immuun-competente muizen. Een combinatie van reportergen etikettering van de cellen, op basis van genetische modificatie met de reporter genen Firefly luciferase en eGFP, en een direct cel etikettering met GB MPIO, leidt tot een nauwkeurige beoordeling van de stamcellen grafts in vivo.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
References
- Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. . Molecular imaging of stem cells. , (2008).
- Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).
- Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain’s innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
- Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
- De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
- Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
- Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
- Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
- Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
- Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
- Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
- Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
- Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
- Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
- Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
- Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
- Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
- Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
- Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
- Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
- Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
- Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
- Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
- Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
- Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
- Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
- Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
- Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).
