Imagerie multimodale d'implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris
Summary
Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, la transplantation de cellules souches a suscité un intérêt croissant en tant que modalité thérapeutique primaire ou secondaire pour une variété de maladies, à la fois dans les études précliniques et cliniques. Toutefois, à ce jour les résultats concernant les résultats fonctionnels et / ou la régénération des tissus après la transplantation de cellules souches sont très variés. En règle générale, un bénéfice clinique est observé sans une profonde compréhension du mécanisme sous-jacent (s) 1. Par conséquent, des efforts multiples ont conduit à l'élaboration des différentes modalités d'imagerie moléculaire pour contrôler la greffe de cellules souches dans le but ultime d'évaluer avec précision la survie, le destin et la physiologie des cellules souches greffées et / ou de leur micro-environnement. Les changements observés dans un ou plusieurs paramètres déterminés par l'imagerie moléculaire pourrait être liée à l'effet observé clinique. Dans ce contexte, nos études portent sur l'utilisation combinée de l'imagerie par bioluminescence (BLI), imagerie par résonance magnétique (IRM) et histologiques analysis pour évaluer les cellules souches de greffage.
BLI est couramment utilisé pour effectuer de façon non invasive suivi de cellules et de surveiller la survie des cellules dans le temps après une transplantation 2-7, basé sur une réaction biochimique dans laquelle les cellules exprimant le gène de la luciférase-rapporteur sont capables d'émettre de la lumière d'interaction suivant avec son substrat (par exemple D- luciférine) 8, 9. IRM d'autre part est une technique non invasive qui est cliniquement applicable 10 et peut être utilisé pour localiser précisément des greffes cellulaires à très haute résolution 11-15, même si sa sensibilité dépend fortement le contraste généré après marquage des cellules avec un agent de contraste IRM . Enfin, post-mortem analyse histologique est la méthode de choix pour valider les résultats de recherche obtenus avec des techniques non invasives avec la plus haute résolution et la sensibilité. Par ailleurs point final analyse histologique nous permet d'effectuer une analyse détaillée des phénotypique des cellules greffées et / ou les tissus environnants, based sur l'utilisation des protéines rapporteurs fluorescents et / ou d'étiquetage directe de la cellule avec des anticorps spécifiques.
En résumé, nous avons ici démontrer visuellement les complémentarités de BLI, l'IRM et l'histologie de démêler les cellules souches et différente / ou de l'environnement associée à des caractéristiques suivantes sur les cellules souches de greffage dans le SNC de la souris. A titre d'exemple, la moelle osseuse de cellules dérivées du stroma, génétiquement modifiées pour exprimer la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et la luciférase de luciole (fluctuations), et étiquetés avec le bleu fluo de taille micronique des particules d'oxyde de fer (MPIOs), seront greffés dans le SNC de souris immuno-compétentes et les résultats seront suivis par BLI, l'IRM et l'histologie (figure 1).
Protocol
Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole optimisé pour la combinaison de trois modalités d'imagerie complémentaires (BLI, l'IRM et l'histologie) pour la caractérisation détaillée des implants cellulaires dans le SNC de la souris immunitaires compétentes. Une combinaison de l'étiquetage gène rapporteur de cellules, basée sur la modification génétique avec des gènes rapporteurs luciférase de luciole et eGFP, et un étiquetage directe de la cellule avec Go MPIO, conduit à une évaluation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
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