בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות 'נומיקס וירוס אחד "
Summary
ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.
Abstract
ההגברה הגנום כולו ורצף של תאי חיידקים בודדים מאפשרים אפיון גנטי ללא צורך בטיפוח 1-3. וירוסים, שהם נמצאים בכל מקום והגופים הרבים ביותר על הפלנטה שלנו 4 וחשובים בכל הסביבות 5, עדיין לא גילו דרך גישות דומות. כאן אנו מתארים גישה לבידוד ואפיון הגנום של virions יחיד בשם 'נומיקס וירוס אחד "(SVG). SVG מנצל cytometry זרימה לבודד וירוסים בודדים וכל הגברה הגנום להשיג DNA הגבוה מולקולרי משקל גנומית (gDNA) שניתן להשתמש בו ברצף תגובות שלאחר מכן.
Protocol
Discussion
מספר גורמים חשובים חייבים להילקח בחשבון בעת יישום גישות SVG. Genotyping, כפי שבוצע במהלך ניסוי הוכחה של הקונספט-13, אינו אופציה תקפה לבידודים ידועים או סביבתיים כמו פריימרים משומרים אינם זמינים בכל הקבוצות ויראליות. כמו כן, סינתזת דנ"א רקע או הגברה ספציפיות ומדוו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לקן Nealson לתובנה שלו והייעוץ לאורך כל תהליך הכנת כתב היד.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
