'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析
Summary
単一のウイルスゲノム（SVG）は、単一のビリオンのゲノムを分離して増幅する方法である。混合された集合体のウイルス懸濁することにより、ビリオンを捕捉し、下流の処理中にゲノムせん断を低減、アガロースを含む個別のウェルを有する顕微鏡スライド上にフローサイトメトリーを用いてソートされる。全ゲノム増幅は、配列決定のために適しているゲノム材料をもたらす複数の置換増幅（MDA）を用いて達成される。
Abstract
単一の微生物細胞の全ゲノム増幅および配列決定は、栽培1-3を必要とせずにゲノム特性評価を可能にします。ユビキタスと私たちの惑星4上で最も数多くのエンティティとすべての環境5で重要であるウイルスは、同様のアプローチを介して明らかにされていない。ここでは、 'シングルウイルスゲノミクス'（SVG）と呼ばれる単一のビリオンのゲノムを単離し、特徴付けるためのアプローチについて説明します。 SVGは、その後の配列決定反応に用いることができる高分子量のゲノムDNA（gDNAを）を得るために、個々のウイルスおよび全ゲノム増幅を分離するためにフローサイトメトリーを利用する。
Protocol
1。ウイルス懸濁液の調製フローサイトメトリーを経由して、単一のビリオンの分離前に、固定されていないウイルスの懸濁液を調製。 必ず最後のウイルス懸濁液を作る以前に確立されたプロトコルを使用してウイルス粒子を分離する0.1μmのフィルターTE（トリス-EDTA、pHが8）に含まれています。我々は、他の方法が使用化学凝集7が開発されているが?…
Discussion
SVGの手法を適用する際に重要な多くの要因を考慮しなければならない。ジェノタイピングは、概念実証実験13の間に行われたように、保存されたプライマーはすべてのウイルスのグループ間で利用できないなどの環境や未知の分離のための有効なオプションではありません。また、バックグラウンドDNA合成又は非特異的な増幅は、一般的にMDA反応14を用いて増幅中に報告され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿の準備プロセスを通して彼の洞察とアドバイスをケンNealsonに感謝したいと思います。
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
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Cite This Article
Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using ‘Single Virus Genomics’. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).