JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Измерение активности фактора V в плазме крови человека с помощью анализа микропланшетов коагуляции

Published: September 09, 2012
doi:
10.3791/3822
, ,
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science,University of Ontario Institute of Technology , 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology , 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology

Summary

Это исследование описывает роман анализа планшет, который измеряет FV свертывания деятельности в фибрин тромба в плазме крови человека, которая не была сообщалось ранее. Метод использует кинетическую планшетного для непрерывного измерения изменения поглощения при 405 нм в течение фибрина тромба в плазме крови человека.

Abstract

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.

This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only μl quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity – 1-stage activity).

Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).

The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

Protocol

1. Подготовка FV-дефицитной плазме крови человека Этот метод является модификацией процедуры первоначально описывается Блум и др. 4. Получить всю человеческую кровь от согласию здоровых взрослых добровольцев (мужчина или женщина, возраст 18 – 50 лет), что не принимает никаких лекарств. Носите резиновые перчатки и лабораторный халат на протяжении всей процедуры. Подготовьте 100 мл 3,2% (вес / объем) тринатрийцитрат в дистиллированной воде. Загрузите 6,0 мл этого раствора в отдельный шприц 60 мл. Удалите воздух угнетает плунжер тщательно 6,0 мл отметки на шприце. Используйте тампоном, смоченным спиртом, чтобы очистить область локтевой вены между бицепсы и предплечья. Подключите 20 калибра бабочка аппарат на 3 шприца мл. Вставьте бабочку иглой в локтевую вену и делать мягко на поршень, пока кровь заполняет на 3 знака мл. Удалите шприц с кровью. Этот шаг выполняется для удаления тканевого фактора выпустили из поврежденного эндотелия на иглеместо повреждения, которые могут активизировать процесс коагуляции и мешать подготовке FV-дефицитной плазмы. Подключите бабочку игла "загружается" с 6,0 шприц 60 мл цитрата мл тринатрия и сделать аккуратно на поршень до крови достигает 60 мл отметки на шприце. (Final 10.9mm концентрации цитрата). Удалите шприц с иглой бабочкой и аккуратно перемешать шприца, держа палец в перчатке или большим пальцем на шприц розетки. Продолжить взятии крови в 60 мл шприца заполненных 6,0 мл 3,2% тринатрийцитрата как описано выше. Следует ожидать восстановления примерно 50% от объема цитратной крови как плазмы после центрифугирования и 50 мкл FV-плазмы с дефицитом требуется за образец в планшет анализа. Наша лаборатория регулярно обрабатывает 300-420 мл цитратной крови во время, используя 5-7 х 60 мл шприцев каждый с 6,0 мл 3,2% тринатрийцитрат / шприц. Этого достаточно, FV-дефицитной плазмы около 3000 микро-пластину анализов (см. ниже). Удалить бабочка иглу из рук волонтеров и нажмите стерильной марли площадку на месте прокола вены в течение 1,0 мин. Крышка сайте прокола вены стерильную повязку. Центрифуга цитратной крови при 3300 х г в течение 20 мин при комнатной температуре. Восстановление верхнего слоя желтой плазмы пластиковый стакан с мешалкой с помощью пластиковой пипетки передачи осторожно, чтобы не нарушить нижний красный и белый слой клеток крови. Измерение объема плазмы в мл и сохранить 100 мкл плазмы до того EDTA на льду в течение будущего времени сгусток протромбина (PT) тестирования (см. ниже). Медленно добавьте твердый EDTA к цитратной плазмы при слабом перемешивании при комнатной температуре до достижения 5 мм (конечная концентрация). После того, EDTA не растворится, отрегулировать рН до 7,0, добавляя по каплям 1,0 М NaOH при осторожном перемешивании. Крышка стакана с Саран Wrap и инкубировать в течение 8-10 часов без перемешивания при 37 ° C. Каждые 2 часа, восстановить 100 мклEDTA обработанных плазмой на льду и определения PT во время инкубации с ЭДТА и сравнить с PT плазмы до того EDTA (см. выше). Для определения PT, место съемных 8 хорошо полос immunomodule в пластиковый держатель шаблон и вставить в планшет читателя. Orient immunomodule полосы в микропланшетов читателя: пусто, пусто, образец, пусто, пусто, образец, пусто, пусто и слева направо в шаблоне держатель для минимизации интерференции света разброс из соседних образцов содержащих полосы. Кроме того, используйте только 2-7 скважин сверху вниз в каждом 8 хорошо полосу immunomodule, чтобы минимизировать интерференцию света разброс от краев пластиковый держатель шаблонов. Анализ FV планшет способен измерять фибрина образования сгустка, по крайней мере 12 различных образцов одновременно (6 проб в immunomodule полосы более 2 полос immunomodule). С помощью многоканальной пипетки внести 50 мкл HBS (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4) докаждый лунку для каждого образца для проведения анализа. Использование одной пипетки внести 50 мкл нормальные человеческие объединения ссылкой плазмы (НПЗ) или плазмы перед добавлением ЭДТА или в разное время инкубации после добавления ЭДТА отделить лунок. С помощью многоканальной пипетки внести 50 мкл тромбопластина (см. ниже метод подготовки) для всех лунок с плазмой, чтобы быть проанализированы. Инкубируйте в микропланшетов читателя при 25 ° С в течение 1 мин и программы микропланшетного, чтобы встряхнуть пластине в течение 15-25 сек 1 мин инкубации. Использование компьютера сопряжена с микропланшетов читателя, доступ SoftMax Pro программного обеспечения планшета приложений. Установить читателя Поглощение, длина волны в 405 нм, режим кинетического, температура до 25 ° C, и программа микропланшетного трясти в течение 5 секунд, и считайте абсорбцию при 405 нм каждые 5 секунд в течение 6 мин. С помощью многоканальной пипетки, добавьте хлорид кальция (50 мкл 25 мм в дистиллированной воде; 2,1 мм по водным видам спортал концентрация) для всех лунок, подождите 15 секунд и нажмите кнопку «Пуск» на панели меню планшета SoftMax Pro, чтобы начать анализ. Определить СТ от поглощения по времени профили в SoftMax Pro, как время достижения половины максимального увеличения поглощения при 405 нм (середина сигмоидальных поглощения по сравнению с кривой времени производится после того тромбопластина и хлорида кальция. См. ниже, рис. 1). Рассчитать FV 1-ступенчатый деятельности с момента Вход Сгусток (сек) против Вход FV активности (ЕД / мл), как показано на рисунке 2А. Для количественной цели, 1шт деятельности FV определяется как деятельность, присутствующих в 1,0 мл NHP до преднамеренного активации с добавлением тромбина (см. ниже, опробование образцов человеческой плазмы с FV 1-этап и 2-ступенчатая планшет коагуляции анализа). Подготовка 4.0l 20 мМ HEPES, содержащего 0,15 М NaCl в дистиллированной воде при слабом перемешивании. Отрегулируйте рН до 7,4 с медленным dropwISE добавлением 5.0M NaOH (HBS, рН 7,4). Получить достаточную длину диализа и тщательно промыть дистиллированной водой. Свяжите узел на одном конце трубки. Передача EDTA рассматривать плазму диализа с пластиковой пипетки передачи, удалить воздух и завязать узел на другом конце трубки. Осторожно повесить EDTA обращение плазмы в трубку в HBS при осторожном перемешивании. Крышка с Саран Wrap и диализ для 14-16ч при слабом перемешивании при температуре 4 ° C. Осторожно снимите EDTA-treated/dialyzed плазмы в 3,0 мл аликвоты до 15,0 мл винт крышкой трубы и сохранить 100 мкл для анализа PT из "окончательное" FV-плазмы с дефицитом на льду. Хранить FV-плазмы с дефицитом, по крайней -80 ° C до использования. В условиях, описанных выше, увеличение СТ от 10-15 секунд до EDTA дополнение к 90-100 сек 8-10 часов после того EDTA. FV-плазмы с дефицитом подготовленных этим методом обычно содержит менее 0,1% от активного настоящее FV в стартовыхсвежей человеческой плазмы. 2. Подготовка тромбопластина Диализ требует, чтобы удалить кальций из этого реагента для того, чтобы позволить точно сроки формирования фибринового сгустка от времени кальция хлорида того, чтобы инициировать процесс коагуляции. Подготовьте 100 мл и 4,0 л 20 мМ HEPES и 0,15 М NaCl в дистиллированной воде в пластиковых стакана при осторожном перемешивании. Отрегулируйте рН до 7,4 с медленным каплям 5.0M NaOH (HBS, рН 7,4). Добавить 6,0 мл HBS, рН от 7,4 до каждого флакона реагента тромбопластина, заменить крышку, и слегка встряхнуть, чтобы раствориться. Инкубируйте реагента в крышкой флакона в течение 15 мин при комнатной температуре для растворения сухого материала. Слегка встряхнуть до полного растворения. Вырезать достаточной длины диализа, хорошо промыть дистиллированной водой, и завязать с одного конца трубки с узлом. Передача тромбопластина, чтобы диализа, удалить воздух и завязать другой конец трубки с узлом. Калифорнияrefully повесить диализа в 4.0l из HBS, рН 7,4 и осторожно перемешать покрыты Саран Wrap при 4 ° С в течение 14-16 часов. Передача 3,0 мл аликвоты диализованной тромбопластиновое до 15 мл винт крышкой труб и хранят при -80 ° C до использования. 3. Подготовка FV 1-ступенчатый микропланшетов коагуляции анализа кривых активность Стандартный Оттепель FV-дефицитной плазмы, NHP, и тромбопластина при 37 ° С в течение 10 мин. Аккуратно перемешайте FV-дефицитной плазмы и тромбопластина самостоятельно, трансфер в отдельных пластиковых стиральная лотки, и инкубировать на льду. Хранить NHP на льду после того, как нежно перемешивания. Магазин хлорида кальция (25 мм в дистиллированной воде) в отдельный лоток для стирки при комнатной температуре. Подготовка 200 мкл каждого из 2-кратные серийные разведения NHP от 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-раз в HBS, рН 7,4 с использованием 1,5 Трубы мл микроцентрифуге. Vortex и инкубировать на льду. Поместите съемную 8 хорошо полос immunomodule в рLastic держатель шаблон и вставить в планшет читателя. Orient immunomodule полосы в микропланшетов читателя: пусто, пусто, образец, пусто, пусто, образец, пусто, пусто и слева направо в шаблоне держатель для минимизации интерференции света разброс из соседних образцов содержащих полосы. Кроме того, используйте только 2-7 скважин сверху вниз в каждом 8 хорошо полосу immunomodule, чтобы минимизировать интерференцию света разброс от краев пластиковый держатель шаблонов. Анализ FV планшет способен измерять фибрина образования сгустка, по крайней мере 12 различных образцов одновременно (6 проб в immunomodule полосы более 2 полос immunomodule). Включите планшет читателя и доступ SoftMax Pro планшет прикладного программного обеспечения. С помощью многоканальной пипетки, сделать одновременное добавление FV-плазмы с дефицитом (50 мкл) для всех образцов лунок. Используйте одно пипетки внести 50 мкл 10 серийных разведений NHP полученного выше отделить лунок. С помощью многоканальной пипетки, добавьте тромбопластина (50 мкл) для всех образцов скважин. Инкубируйте в микропланшетного при 25 ° C в течение 1 мин и программы микропланшетного пожать пластины в 15-25 сек 1 мин инкубации. Использование компьютера сопряжена с микропланшетов читателя, доступ SoftMax Pro программного обеспечения планшета приложений. Установить читателя Поглощение, длина волны в 405 нм, режим кинетического, температура до 25 ° C, и программа микропланшетного трясти в течение первых 5 секунд после того кальция хлорида, и мера поглощения при 405 нм каждые 5 секунд в течение 6 минут после этого. 5 сек встряхивания интервал не входит в расчетную раз сгусток (см. ниже). С помощью многоканальной пипетки, добавьте хлорид кальция (50 мкл 25 мм в дистиллированной воде; конечной концентрации 3,5 мм) для всех образцов лунок, подождите 15 секунд, нажмите кнопку "Пуск" иконки в планшет применение в SoftMax Pro от компьютера, чтобы начать анализа. TОн сгусток раз рассчитывается как время в секундах, для достижения средней точки между минимальной и максимальной оптической плотности при 405 нм после того тромбопластина и хлорида кальция. Начальные скорости образования сгустка рассчитывается как темп роста оптической плотности при 405 нм (mUnits / мин), которые охватывают первые 5 моментов времени образования сгустка в линейной части кривой поглощения от времени. Степень образования сгустка рассчитывается как разница между максимальной и минимальной оптической плотности при 405 нм (Units), достигнутых в ходе формирования сгустка событий. 4. Пробирного человека Образцы плазмы с FV 1-этап и 2-ступенчатая микропланшетов коагуляции анализа Оттепель FV-дефицитной плазмы, NHP, образцы плазмы и тромбопластина при 37 ° С в течение 10 мин. Аккуратно перемешайте FV-дефицитной плазмы и тромбопластина самостоятельно, трансфер в отдельных пластиковых стиральных ELISA лотки, и инкубировать на льду. Хранить NHP и образцы плазмы на льдуПосле перемешивания аккуратно. Магазин хлорида кальция (25 мм в дистиллированной воде) в отдельный лоток для стиральных ELISA при комнатной температуре. Подготовка 200 мкл каждого из 40-кратного разведения NHP и образцы плазмы в HBS, рН 7,4 с использованием 1,5 мл пробирок микроцентрифуге. Vortex и инкубировать на льду. Вставьте съемных 8 хорошо полос immunomodule в пластиковый держатель шаблон и вставить в планшет читателя. Альтернативный пусто, пусто, образец, пусто, пусто, образец, пустой, и пустые immunomodule полосы слева направо в шаблоне держатель для минимизации интерференции света разброс из соседних образцов содержащих полосы. Используйте только 2-7 скважин сверху вниз в каждом immunomodule полосы для минимизации интерференции света разброс от краев пластиковый держатель шаблонов. Включите планшет читателя и доступ SoftMax Pro планшет прикладного программного обеспечения. С помощью многоканальной пипетки, добавьте FV-плазмы с дефицитом (50 мкл) для всех образцов лунок. Использование синглэлектронной пипетки внести 50 мкл 40-кратного разбавленного NHP или образцы плазмы, полученной выше отделить лунок. С помощью многоканальной пипетки, добавьте тромбопластина (50 мкл) для всех образцов скважин. Инкубируйте в микропланшетного при 25 ° C в течение 1 мин и программы микропланшетного пожать пластины в 15-25 сек 1 мин инкубации. Использование компьютера сопряжена с микропланшетов читателя, доступ SoftMax Pro программного обеспечения планшета приложений. Установить читателя Поглощение, длина волны в 405 нм, режим кинетического, температура до 25 ° C, и программа микропланшетного трясти в течение первых 5 секунд после того кальция хлорида, и мера поглощения при 405 нм каждые 5 секунд в течение 6 минут после этого. 5 сек встряхивания интервал не входит в расчетную раз сгусток (см. ниже). С помощью многоканальной пипетки, добавьте хлорид кальция (50 мкл 25 мм в дистиллированной воде; 6.25мм конечная концентрация) для всех образцов лунок и сразу пр.ESS "Пуск" иконки в планшет применение в SoftMax Pro от компьютера, чтобы начать анализ. В конце счете, определяют время, начальная скорость и степень образования сгустка для 40-кратного разбавленного NHP и образцы плазмы от поглощения от времени профили в SoftMax Pro. С учетом 40-кратного разведения, используя сгусток времени для каждого образца для расчета активности FV в ед / мл с FV 1-этап деятельности стандартная кривая Вход Время Clot против Вход FV активности (рис. 2A). Это представляет собой FV-1 этапе деятельности или, что без "преднамеренное" активация тромбином. С FV активируется тромбином в активную кофактора, FVA 1, второй после анализа того и инкубации с тромбином имеет решающее значение для точного измерения FV 2-ступенчатый активности образца плазмы (с "преднамеренное" активация добавил тромбина). Для FV 2-ступенчатый анализ, подготовить 200-300 мкл очищенного тромбина 18т 100 Нм в HBS, рН 7,4 и инкубируют на льду. Планируется использовать 10 мкл разбавленного тромбина для каждого образца плазмы быть проанализированы с FV 2-ступенчатый анализ. Развести 120 мкл выше NHP и образцы плазмы от 40-кратного до 100-кратного с 170 мкл HBS, рН 7,4, содержащий 2,8 мм хлорида кальция. Добавить 10 мкл тромбина (10 нм конечная концентрация) для каждого образца. Vortex хорошо перемешать и инкубировать при 37 ° С в течение 1 мин. Развести NHP и образцы плазмы в 500-кратном путем добавления 400 мкл HBS, рН 7,4, вихрем хорошо, и анализ 50 мкл каждого образца плазмы в FV 1-ступенчатый планшет анализа, как описано выше. Определить сгусток времени для NHP и каждого образца плазмы анализировали от поглощения по времени профили в SoftMax Pro. Принимая во внимание 500-кратном разведении, используйте сгусток времени для каждого образца для расчета FV 2-ступенчатый деятельности с FV 1-ступенчатый стандартной кривой Log время Clot против Вход FV активности (рис. 2A). Общая FV деятельти может быть рассчитана как FV 2-ступенчатый деятельности – FV 1-этап деятельности.

Representative Results

Представитель Результаты – Подготовка FV 1-ступенчатый планшет коагуляции анализа кривых деятельности стандартную Представитель пример фибрина тромба в анализе FV с течением времени порожденных микропланшетов читателя показано на рисунке 1. Анализ FV точно измеряет время, начальная скорость и степень образования сгустка фибрина. Инспекция скважин на завершение анализа подтвердили, что сгустка произошло. Все реакции достигается примерно в той же степени образования сгустка с общим изменением оптической плотности при 405 нм в 0,35 – 0,45 единиц между начальной поглощения до и после максимальной абсорбции тромбопластина и добавление хлорида кальция. Типичные примеры FV 1-ступенчатый деятельности стандартных кривых Вход Clot время (в секундах) по сравнению Вход FV активности (МЕ / мл) и Вход начальная скорость образования тромба (в mUnits / мин) по сравнению Вход FV активности (ЕД / мл ) для серийных разведений NHP показано в <stronг> Рисунок 2А и 2В рис, соответственно. Установка логарифмическом сгустка время против FV 1-активность указанных сильная взаимосвязь между этими переменными после анализа линейной регрессии (рис. 2А, R 2 = 0,980). Установка логарифмическом начальной скорости образования сгустка против активность FV также указал, сильная взаимосвязь между этими переменными после анализа линейной регрессии (рис. 2В; R 2 = 0,983). Отношения время как сгусток Вход и Выход начальная скорость образования тромба против Вход FV активность оставалась линейной для NHP разбавляют до 512 раз. С FV циркулирует в NHP приблизительно в 12-40-нм 16, планшет анализ является чувствительным к примерно 24-80pM FV в NHP. Учитывая, что константа диссоциации взаимодействия FVA-FXa-липидов в протромбиназы составляет около 1 нм 17, анализа FV планшет вполне подходит для измерения уровня FV в физиологически relevanт нм для FVA функции в протромбиназы. С помощью анализа FV планшет, было также установлено, что нормальный диапазон FV деятельности в FV 1-этап анализа деятельности 15 здоровых плазмы управления (мужской и женский, возраст 18-20yrs) был (среднее ± стандартное отклонение; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Это хорошо согласуется с нормальной здоровой деятельности FV и диапазон (0.66-1.14U/ml) сообщила Катлер и соавт. для FV 1-этап деятельности определяется с помощью автоматического анализатора 7. Внутри-анализ изменчивости времени, степени и начальная скорость образования тромба в FV 1-ступенчатый тест в 6 скважин на 8 различных дней составила 3,4%, 4,4% и 3,1%, соответственно. Между сериями изменчивости времени, степени и начальная скорость образования тромба в FV 1-ступенчатый тест в 6 скважинах 8 различных экспериментов на 8 различных дней составила 7,1%, 7,8% и 9,2%, соответственно. Таким образом, внутри-и меж-анализа вариабельности этих трех измереннойкрасных переменных была на низком и приемлемым уровнем для надежного проведения теста внутри и между планшет анализа нескольких образцов одновременно (до 12). Представитель Результаты – пробирного образцов человеческой плазмы с FV 1-этап и 2-ступенчатая планшет коагуляции анализа Стандартная кривая Вход Clot время против Activity Log FV (рис. 2A) был использован для измерения активности FV в NHP и 9 DIC плазмы пациента, которые не были намеренно активированы с добавлением тромбина (FV 1-этап деятельности) или были намеренно активированы Добавлен тромбина (FV 2-ступенчатый деятельности) и результаты представлены в таблице 1. Все 9 DIC плазмы пациента выставлены FV 1-этап деятельности и начальных скоростей образования сгустка, что были снижены в среднем на 54% и 18%, соответственно, от NHP. Экстентов образования тромба в FV 1-ступенчатый анализ в ОПК пациенты не были в значительной степени отличается от НПЗ, и увеличилась в среднем на 13% от NHP. Активация NHP с тромбином генерируется приближенных 8-кратное увеличение FV 2-ступенчатый деятельности над FV 1-этап деятельности (табл. 1). Это означает, что FV в NHP, в основном, на его неактивированной форме и согласуется с ранее сообщал результаты с помощью ручного наклона трубы FV анализы 3, 4 и автоматизированного анализа FV 5-7. FV 2-этап и общая активность также снизилась в ОПК пациентов в среднем на 44% и 42%, соответственно, от NHP. Начальные скорости и степени образования тромба в FV 2-ступенчатый анализ в ОПК больных существенно не отличается от НГЗ, и колебалась в среднем, примерно на 9% и 4%, соответственно, от наблюдаемого с NHP. Эти результаты показали, что по сравнению с FV в НПЗ, FV в ОПК плазме пациентов в результате длительного времени и снижение скорости образования сгустка фибрина и что пациент FV составляла в среднем лишь 56%, как активируемый тромбином, а также. ENT "FO: Keep-together.within-страницы =" Всегда "> Рисунок 1. Тромба в нормальном объединенной человеческой плазмы ссылкой измеряется с помощью кинетического планшет FV 1-этап свертывания анализа. Фибрина тромба в NHP был постоянным контролем при 405 нм использованием кинетической планшетного. Сюжет выход планшета читатель 6 мин реакция 32-кратно разбавленного НПЗ, FV-плазмы с дефицитом, тромбопластин, и хлористый кальций в лунку. Вертикальная ось представляет собой изменение оптической плотности при 405 нм, которое произошло в результате фибрина в плазме крови. Время образования фибрина был определен как время достижения половины максимального увеличения поглощения или центральной части кривой (36,40 сек). Начальная скорость образования сгустка определяется как скорость изменения оптической плотности при 405 нм в течение первых 5 временных точках линейного увеличения поглощения части кривой (611,88 mUnits / мин). Экспалатки образования сгустка определяется как разница между максимальной и минимальной оптической плотности при 405 нм (0,35 единицы). Рисунок 2. Стандартные кривые времени и начальную скорость образования тромба против активности фактора V в нормальном объединенной человеческой плазмы ссылки с помощью FV 1-ступенчатый планшет анализа. NHP серийно разводили (0 – до 512 раз в HBS) и анализировали с FV 1-ступенчатый планшет анализа, как описано в протоколе. Log-Log участков времени и начальную скорость образования тромба против FV деятельности в FV 1-ступенчатый планшет анализа показаны после линейной модели регрессии данных в панели А и В, соответственно. Образец 1-ступенчатый анализ активности (ЕД / мл) 1-ступенчатый анализ степени (единиц) <tD> 1-ступенчатый анализ начальной скорости (mUnits / мин) 2-этап анализа активности (МЕ / мл) 2-ступенчатый анализ степени (единиц) 2-ступенчатый анализ начальной скорости (mUnits / мин) Всего активности (МЕ / мл) NHP 1,02 0,363 744,96 7,93 0,433 375,84 6,91 Пациент 1 0,36 0,404 583,80 3,84 0,432 249,96 3,48 Пациент 2 0,67 0,416 704,04 5,28 0,469 323,16 4,61 <strong> Пациент 3 0,31 0,435 562,08 3,92 0,453 294,96 3,61 Пациент 4 0,39 0,435 617,04 4,14 0,462 372,60 3,75 Пациент 5 0,73 0,401 641,40 5,91 0,433 354,24 5,18 Пациент 6 0,45 0,403 600,72 4,16 0,445 393,96 3,71 Пациент 7 0,49 0,395 575,40 4,89 0,449 357,48 4,40 Пациент 8 0,19 0,448 489,00 2,89 0,450 330,48 2,70 Пациент 9 0,64 0,423 699,48 5,11 0,455 417,24 4,47 Таблица 1 FV деятельности в NHP и у 9 пациентов, что развитые диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром). FV 1-ступенчатый, 2-ступенчатый, а общая активность в NHP и 9 DIC плазме пациентов были определены из FV 1-ступенчатый планшет проба Кривая времени образования сгустка против FV деятельности (рис. 2A) и приведены в ед / мл. Начальные скорости (начальная скорость роста A405nm за первые пять моментов времени в mUnits / мин) и степени (максимальная A405nm – Минимальная A405 нм) образования сгустка в FV 1 – и 2-ступенчатая планшет анализ также показал.

Discussion

Кинетический метод анализа планшета описывает развитие романа, быстрый, недорогой и удобный метод для измерения активности свертывания FV в образцах плазмы крови человека, которые не имеют (FV 1-этап анализа) или были намеренно активированы с добавлением тромбина (FV 2-этап анализа). Анализ использует кинетическую планшетного и все материалы и реагенты являются коммерчески доступными или могут быть сделаны в доме. Анализ непрерывно следит за изменением светорассеяния плазмы во время формирования фибринового сгустка при 405 нм. Анализ планшет имеет то преимущество, используя небольшие образцы плазмы томах (мкл) и поддается анализа нескольких образцов одновременно (до 12). Эти анализе атрибутов выгодно, когда дорогостоящее оборудование и реагенты используются (автоматические анализаторы и Фактор-дефицитных плазм), и только небольших объемов образцов доступны (Patient плазмы) или анализ большого количества образцов (F Во время очистки FVROM плазмы).

Анализ FV планшет имеет дополнительное преимущество, что это удобно, быстро и не требует выделения и очистки необходимые компоненты составляющей. По сравнению с ручным наклоном трубки 3, 4 и 5-7 автоматизированного анализа FV, которые были зарегистрированы, анализ FV планшет имеет сопоставимые полезный диапазон сгусток раза (25-75 сек) и соответствующих уровней FV в образце (0.5-0.005 единиц / мл) и чувствительности / пределов обнаружения (20-80pM). По сравнению с ручным наклоном труб FV анализов, которые страдают от субъективной визуальной оценки образования сгустка 3, 4, анализ FV планшет позволяет объективного и количественного измерения сгусток времени, начальной скорости и степени образования сгустка фибрина. По сравнению с автоматизированными анализы FV, которые страдают от требований дорогие анализаторы и реагенты 5-7, FV планшет анализа реактивы и материалы недороги и все необходимые материалы могут быть purchaСЭД коммерческой или сделаны в доме. Руководство наклона трубки 3, 4 и 5-7 автоматизированного анализа FV вообще только предоставить время для сгустка; не время, начальная скорость и степень формирования фибринового сгустка, которые все точно измерена спектрофотометрически с анализом FV микропланшетов. Наконец, руководство наклона трубки 3,4 и автоматизированных 5-7 анализов FV страдают от только возможность для измерения активности FV в образцах плазмы по одной за раз, тогда как анализ FV планшет поддается высокой пропускной способностью и 12 образцов может быть анализировать одновременно.

Анализ планшет был использован для продемонстрировать, что FV в 9 DIC плазмы пациента была менее активной, чем в NHP из-за сочетания задержки раза сгустка и более низкую начальную скорость свертывания крови в FV 1-этап анализа. Начальных скоростей образования тромба в FV 2-ступенчатый анализ в ОПК плазмы пациента не было изменено с NHP. Экстентов образования тромба в ОПК patienт плазмы также не изменился с NHP в FV 1-этап и 2-ступенчатая анализов. Снижение FV 1-ступенчатый, 2-ступенчатый, а общая деятельность может быть связано с увеличением потребления FV 19 и / или инактивации 6 в соответствии с другими исследованиями в патогенезе этого приобрел заболевание крови. Учитывая степень образования сгустка в плазме DIC был таким же, как это наблюдается с NHP, эта переменная, скорее всего, в результате концентрации фибриногена в FV-плазмы с дефицитом и не связаны с характеристиками пациента плазмы.

Результаты анализа показали, что планшет измерения FV активности в образцах плазмы крови человека могут быть получены от времени и начальную скорость образования тромба из FV 1-этап анализа и время образования тромба и общей деятельности с FV 2 – этап анализа. Не удалось получить количественные измерения активности FV в образце плазмы в зависимости от степени образования тромба в тОн FV 1 – и 2-ступенчатая анализы или начальная скорость образования тромба в FV 2-ступенчатый анализ. Учитывая все реакции достигается примерно в той же степени образования тромба в 0,35 – 0,45 единиц между начальной поглощения до и после максимальной абсорбции тромбопластина и добавление хлорида кальция, измерение степени образования сгустка не дать количественную оценку деятельности FV в данного образца плазмы.

Роман анализа планшет найдут применение в научных исследованиях и клинических условиях для измерения активности FV в образцах плазмы крови человека и фракций во время очистки от человека и животных плазмы. Микропланшетов анализ может быть использован для измерения времени, начальной скорости и степени образования сгустка; параметры как правило, не отслеживать одновременно в ручном наклона трубки анализы и автоматических анализаторов свертывания крови. Эта информация предоставляет более полной количественной оценки участия FV во время формирования сгустка событияВ плазме крови человека, чем сообщалось ранее 3-7. Эта информация особенно важна в обоих исследованиях и клинических лабораториях при измерении значительных изменений в FV активности в образцах плазмы или с очищенной FV или УСС. Анализ FV планшет можно также использовать для характеристики и оценки соединений, которые могут активировать или деактивировать FV и УСС, измерения активности ФВ у пациентов с риском для венозного тромбоза в результате мутации FV Leiden 20, 21 и следить за деятельностью FV во время ее очистки от плазмы.

Анализ FV планшет легко адаптируется для оценки деятельности любого фактора свертывания крови во внешнем, внутренняя, или общий путь использованием соответствующего фактора плазмы с дефицитом и начать реагентов для формирования фибрина. Анализ увеличит наше понимание биохимии FV через более точную и полную оценку его деятельности в научных исследованиях и клинических лабораторий. Конечныйют, эта информация будет положительно влиять здравоохранения среды посредством ранней диагностики и разработки более эффективных методов лечения для людей, страдающих с нарушениями свертывания крови, таких как ОПК.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке со профессионального развития и исследований Startup средств из университета Онтарио технологический институт (UOIT) доктора Джона А. саами и Канадский институт исследований в области здравоохранения медицинских работников студенческих исследований премии Ирина Левит. Авторы признают, Шеннон Эверетт (преподавание и обучение центр, UOIT) за ее помощь подготовку видео. Авторы признают, д-р Майкл Э. Nesheim (кафедра биохимии, Университет королевы, Kingston, ON) за наставничество, понимание и полезные обсуждения. Кроме того, авторы признают, д-р Чен Hock Toh (Роальд Даль Гемостаз и тромбоз центр, Royal Liverpool University Hospital, Ливерпуль, Великобритания) для обеспечения ОПК плазмы пациента, используемых в исследовании.

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments (Optional)
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

Factor V ActivityHuman PlasmaMicroplate Coagulation AssayBlood CoagulationThrombinFibrinogenClot FormationProthrombinaseFV AssaysAutomated FV AssaysMicroplate PlatformEnzyme-catalyzed EventsClot LysisPlatelet AggregationCoagulation FactorsFV Activity MeasurementKinetic Microplate ReaderAbsorbance Change At 405nm

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image