Deze studie beschrijft een nieuwe microplaat test die FV stollingsactiviteit tijdens fibrine stolselvorming in menselijk plasma die niet eerder gerapporteerd. De methode gebruikt een kinetische microplaatlezer de verandering in absorptie bij 405 nm meet continu in fibrine stolselvorming in menselijk plasma.
In reactie op letsel is bloedstolling geactiveerd en resulteert in het genereren van de stolling protease, trombine. Trombine splitst fibrinogeen in fibrine welke een bloedklonter die onoplosbaar bloeding stopt. Factor V (FV) in zijn geactiveerde vorm, FVa, een kritische co-factor voor de protease FXa en versneller van trombinevorming in fibrine stolselvorming als onderdeel van protrombinase 1, 2. Manual FV assays zijn beschreven 3, 4, maar ze zijn tijdrovend en subjectief. Geautomatiseerde FV assays gemeld 5-7, maar de analysator en reagentia duur en vaak enkel de stollingstijd, niet de snelheid en mate van fibrinevorming. De microplaat platform voorkeur voor het meten enzymgekatalyseerde events vanwege gemak, tijd, kosten, klein volume, continue monitoring en high-throughput 8, 9. Microplate assays zijn beschreven voor stolsellysis 10, bloedplaatjesaggregatie11 en stollingsfactoren 12, maar niet voor FV activiteit in menselijk plasma. Het doel van de werkwijze was een microplaat test die FV activiteit tijdens fibrinevorming in menselijk plasma te ontwikkelen.
Deze nieuwe microtiterplaat schetst een eenvoudige, goedkope en snelle analyse van FV activiteit in humaan plasma. De assay gebruikt een kinetische microplaatlezer de absorptieverandering bij 405 nm te volgen tijdens fibrinevorming in humaan plasma (Figuur 1) 13. De assay meet nauwkeurig de tijd initiële snelheid en omvang van fibrine stolselvorming. Het vereist slechts pl hoeveelheden plasma, volledig in 6 min, high-throughput, gevoelig voor 24 80pM FV, en meet de hoeveelheid onbedoeld geactiveerd (1-traps activiteit) en trombine-geactiveerde FV (2-traps activiteit 1-traps activiteit) -) om een volledige beoordeling van de totale functionele activiteit (2-traps activiteit te verkrijgen.
Verspreid intravasCular coagulatie (DIC) is een verworven coagulopathie die het vaakst ontwikkelt van reeds bestaande infecties 14. DIC is geassocieerd met een slechte prognose en verhoogt mortaliteit boven de bestaande pathologie 15. De assay werd aangetoond dat 9 patiënten met DIC, de FV 1-traps, 2-traps, en totale activiteiten verminderd met gemiddeld 54%, 44% en 42% respectievelijk, vergeleken met normale gepoolde humane referentie-plasma (NHP).
De FV microplaat assay gemakkelijk op de activiteit van een stollingsfactor meten. Deze test zal een beter begrip van FV biochemie door een nauwkeurige en volledige meting van de activiteit in onderzoek en klinische instellingen. Deze informatie zal een positieve invloed hebben gezondheidszorg omgevingen door middel van vroegere diagnose en de ontwikkeling van meer effectieve behandelingen voor stollingsstoornissen, zoals DIC.
De kinetische microplaat assay methode wordt de ontwikkeling van een nieuwe, snelle, goedkope en geschikte techniek voor het meten van FV stollingsactiviteit in monsters van menselijk plasma die (FV 1-fase test) of met opzet zijn geactiveerd met trombine toegevoegd (FV 2-fase test). De assay gebruikt een kinetische microplaatlezer en materialen en reagentia nodig zijn commercieel verkrijgbaar of kunnen worden gemaakt in-huis. De test bewaakt de verandering in de lichtverstrooiing van plasma tijdens fibrine stolselvorming bij 405 nm. De microplaat test heeft het voordeel dat kleine volumes plasmamonster (ui) en vatbaar voor analyse van meerdere monsters tegelijk (tot 12). Deze assay eigenschappen zijn voordelig wanneer dure apparatuur en reagentia gebruikt (Automated analysatoren en Factor-deficiënt plasma) slechts kleine volumes monster beschikbaar (Patient plasma) of analyse van een groot aantal monsters (FV Tijdens zuivering from plasma).
De FV microplate assay heeft als bijkomend voordeel dat het handig, snel, en vereist geen isolatie en zuivering van de gewenste samenstellende componenten. Vergeleken met handmatige tilt-buis 3, 4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays die zijn gemeld, de FV microplaat test heeft vergelijkbare bruikbare gebied van stolsel keer (25-75 sec) en overeenkomstige FV niveaus in het monster (0.5-,005 Units / ml), en gevoeligheid / detectiegrenzen (20 80pM). Vergeleken met handmatige tilt-tube FV assays die lijden aan een subjectieve visuele beoordeling van stolselvorming 3, 4, de FV microplaat assay maakt objectieve en kwantitatieve meting van de stollingstijd, beginsnelheid en omvang van fibrine stolselvorming. In vergelijking met geautomatiseerde FV assays die kampen met de eis van dure analysers en reagentia 5-7, de FV microplaat assay reagentia en materialen zijn goedkoop en alle benodigde materialen kunnen beslissed commercieel of worden gedaan in-house. Handmatige tilt-buis 3, 4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays algemeen alleen de tijd op stolselvorming, niet de tijd initiële snelheid en omvang van fibrine stolselvorming die nauwkeurig alle spectrofotometrisch gemeten met de microplaat FV assay. Tenslotte handmatige tilt-buis 3,4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays lijden alleen de mogelijkheid om de FV te meten in plasma monsters een voor een, dat de FV microplaat assay vatbaar is voor high-throughput en 12 monsters kan gelijktijdig getest.
De microplaat assay werd aangetoond dat de FV in 9 DIC patiënt plasma was minder actief dan in NHP door een combinatie van een stolsel en lagere initiële snelheden van stolselvorming in de FV 1-fase test. De beginsnelheid van stolselvorming in de FV 2-fase test in het plasma DIC patiënt niet veranderd NHP. De mate van stolselvorming in de DIC patient plasma's werden ook niet veranderd van NHP in de FV 1-traps en 2-traps assays. Verminderde FV 1-traps, 2-traps, en de totale activiteiten kunnen te wijten zijn aan een verhoogde consumptie FV 19 en / of inactivatie 6 in overeenstemming met andere studies in de pathogenese van deze verworven bloedziekte. Gezien de omvang van stolselvorming in de DIC plasma was hetzelfde als waargenomen met NHP, deze variabele was waarschijnlijk een gevolg van de fibrinogeenconcentratie in de FV-deficiënt plasma en niet gerelateerd aan de kenmerken van de patiënt plasma.
De resultaten van de microplaat test aan dat meting van FV in de monsters van humaan plasma kan worden verkregen uit de tijd en initiële snelheid van stolselvorming de FV 1-fase test en de tijd van stolselvorming en totale activiteit van FV 2 – fase test. Het was niet mogelijk om kwantitatieve meting van FV activiteit te verkrijgen in een plasmamonster gebaseerd op de mate van stolselvorming in thij FV 1 – en 2-traps assays of de initiële snelheid van stolselvorming in de FV 2-fase test. Aangezien alle reacties bereikt ongeveer dezelfde mate van stolselvorming van 0,35 tot 0,45 eenheden tussen de initiële absorptie voor en de maximale absorptie na tromboplastine en calciumchloride Bovendien is het meten van de mate van stolselvorming geen kwantitatieve beoordeling van FV activiteit in een aangegeven plasma monster.
De nieuwe assay microplaat vindt gebruik in onderzoek en klinische settings voor het meten van FV in de monsters van humaan plasma en fracties tijdens de zuivering uit humane en dierlijke plasma. De microplaat test kan worden gebruikt om de tijd, beginsnelheid, en mate van stolselvorming meten; parameters niet tegelijkertijd gecontroleerd handmatige tilt tube-assays en geautomatiseerde coagulatie analyzers. Deze informatie geeft meer van een volledige kwantitatieve beoordeling van de betrokkenheid van FV tijdens de stolselvorming evenementin menselijk plasma dan eerder gerapporteerd 3-7. Deze informatie is met name belangrijk in onderzoek en klinische laboratoria bij het meten significante veranderingen in FV in de monsters van plasma of gezuiverd FV of FVa. De FV microplaat test kan ook worden gebruikt om karakteriseren en te meten verbindingen die kunnen activeren of deactiveren FV en FVa, meet de FV activiteit in patiënten met risico op veneuze trombose als gevolg van de FV Leiden mutatie 20, 21 en de activiteit van toezicht FV tijdens de zuivering uit plasma.
De FV microplaat assay gemakkelijk op de activiteit van een stollingsfactor meten in de extrinsieke, intrinsieke of gemeenschappelijke route met een geschikte factor-deficiënt plasma en initiëren reagentia voor fibrinevorming. De test zal een beter begrip van FV biochemie door een nauwkeurige en volledige meting van de activiteit in onderzoek en klinische laboratoria. Ultimately, zal deze informatie een positieve invloed hebben gezondheidszorg omgevingen door middel van vroegere diagnose en de ontwikkeling van meer effectieve behandelingen voor mensen die last hebben met stollingsstoornissen, zoals DIC.
The authors have nothing to disclose.
Het onderzoek werd ondersteund met professionele ontwikkeling en onderzoek Startup fondsen van de Universiteit van Ontario Institute of Technology (UOIT) naar Dr John A. Samis en een Canadese Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award voor Irina Levit. De auteurs erkennen Shannon Everett (Teaching and Learning Centre, UOIT) voor haar hulp bij de voorbereiding van de video. De auteurs erkennen Dr Michael E. Nesheim (Vakgroep Biochemie, Queen's University, Kingston, ON) voor zijn mentorschap, inzicht en nuttige discussies. De auteurs erkennen ook Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl hemostase en trombose Centrum, Academisch ziekenhuis Royal Liverpool, Liverpool, UK) voor het verstrekken van de DIC patiënt plasma's gebruikt in de studie.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |