Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris
Summary
Nous présentons une méthode pour former une fenêtre d'imagerie dans le crâne de la souris qui s'étend millimètres et est stable pendant des mois sans inflammation du cerveau. Cette méthode est bien adaptée pour les études longitudinales de la circulation sanguine, la dynamique cellulaire et cellulaire / structure vasculaire en utilisant la microscopie à deux photons.
Abstract
L'imagerie in vivo de la fonction corticale nécessite un accès optique au cerveau sans interruption de l'environnement intracrânienne. Nous présentons une méthode pour former un crâne poli et armé amincie (ports) fenêtre dans le crâne de la souris qui s'étend sur plusieurs millimètres de diamètre et est stable depuis des mois. Le crâne est amincie à 10 à 15 um d'épaisseur avec une perceuse à main pour réaliser une clarté optique, et est ensuite recouverte d'une colle cyanoacrylate et une vitre de protection à: 1) fournir une rigidité, 2) inhiber la repousse osseuse et 3) réduire la diffusion de la lumière des irrégularités sur la surface osseuse. Depuis le crâne n'est pas violé, une inflammation qui pourrait affecter le processus de l'étude est considérablement réduit. Des profondeurs d'imagerie allant jusqu'à 250 um en dessous de la surface corticale peut être réalisé en utilisant la microscopie biphotonique à balayage laser. Cette fenêtre est bien adapté pour étudier le débit sanguin cérébral et la fonction cellulaire dans les préparations à la fois anesthésiés et éveillés. Il offre en outre l'opportunity de manipuler l'activité des cellules à l'aide optogénétique ou d'interrompre le flux sanguin dans les vaisseaux ciblés par irradiation de la circulation photosensibilisants.
Protocol
Discussion
Imagerie biphotonique à travers une fenêtre ports exige la transmission à travers l'os aminci et la dure-mère, ce qui atténue la lumière laser et ajoute des aberrations optiques à plus grande profondeur 8. Cependant, malgré cet inconvénient, les profondeurs d'imagerie jusqu'à 250 um en dessous de la surface piale peut être atteint avec 900 nm d'excitation. Des profondeurs d'imagerie plus élevés peuvent en principe être possible avec des longueurs d'onde d'excitation p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association (post-doctoral à AYS) et le National Institutes of Health (MH085499, EB003832 et OD006831 à DK). Nous tenons à remercier Beth Friedman et Pablo Blinder pour les commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Agent | Route of delivery | Dose for mouse | Duration | Notes | Source | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 μg/g | 15-60 min | Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) | IP | 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe) |
20-30 min | Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. | (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurane (Isothesia) | Inhalation | 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance | 4-6 h. | Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. | 029403; Butler Schein | 26 |
Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.
| ITEM | COMPANY | CATALOG # / MODEL |
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorphine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight | Sigma | FD2000S |
| Isopropyl alcohol | Fisher | AC42383-0010 |
| Lactated Ringer’s Solution | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaine solution, 2 % (v/v) | Butler Schein | 002468 |
| Saline | Butler Schein | 009861 |
| Surgical Milk | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| DISPOSABLES | ||
| Carbide burrs, 1/2 mm tip size | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Cover Glass, no. 0 thickness | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Cyanoacrylate glue | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip cement powder | Dentsply | 675571 |
| Grip cement solvent | Dentsply | 675572 |
| Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle | Butler Schein | 018384 |
| Nut and bolt to secure the head | Digikey | Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND |
| Opthalmic ointment | Butler Schein | 039886 |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Screws, self-tapping #000 | J.I. Morris Company | FF000CE125 |
| Silicone aquarium sealant | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin oxide powder | Mama’s Minerals | EQT-TINOX |
| EQUIPMENT | ||
| Glass scribe | Fisher Scientific | 08-675 |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Electric powered drill | Foredom or Osada | K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada) |
| Electrical razor | Wahl | Series 8900 |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Feedback regulated heat pad | FHC | 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07) |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulse oximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Screwdriver, miniature | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars) |
| Surgical scissors, blunt end | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.
References
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