Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak hücre canlılığı ve floresan ifade deneyleri nasıl gerçekleştirileceği açıklanır.
Abstract
Tek hücreli ve nüfus bilgileri flow sitometri veya floresan mikroskobu yaygın olarak elde edilir. Ancak, bu iki yöntem farklı bilgiler sağlar. Flow sitometri, fiziksel özellikleri ve boyanması veya ifade hakkında nicel çok parametrik bilgiler verir, ancak görselleştirme için izin vermiyor. Stand-alone floresan mikroskopi görsel veri sağlar, ancak basit nicel ölçümleri 1 için izin vermez.
Heterojen popülasyonları 2 görüntü tabanlı sitometri binlerce hücre hızlı görselleştirme ve eş zamanlı kantitatif analiz sağlayarak, bu iki yöntem arasında bir köprü . Burada, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre 3 kullanılarak hücre canlılığı ve yeşil flüoresan protein (GFP) ifade testleri gerçekleştirmek için bir yöntem sunar. Tali enstrüman, 3-kanal (parlak bir alan, yeşil floresans, kırmızı floresans) benchtop tahlil platformu olduğunu Offers flow sitometri ve floresan mikroskobu üzerinde çeşitli avantajları. Tali sitometresinin, daha az pahalı, daha az tezgah yer kaplıyor, daha az bakım gerektirir ve iş akışı çalışma ve analizler çok daha basit ve hızlı böylece basitleştirilmiş oldu. Tali sitometresinin GFP ve kırmızı floresan proteini (RFP) ifadesi, apoptosis 4-6 ve propidium iyodür ile hücre canlılığı analizi (PI) 7-11 dahil olmak üzere süspansiyon hücre tabanlı testlerin bir dizi gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.
Burada, GFP ifade hücrelerinde hücre canlılığı tahlil yapmak Tali araç kullanımını göstermek. Ölü Hücre Kırmızı – GFP transduced hücreleri Tali Canlılık kiti kullanılarak boyandı. Bu hücreler daha sonra bir Tali Hücresel Analiz Slayt pipetlenir ve sitometresinin içine yüklenir. Aydınlık alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntü yakalanır ve tahlil özel algoritmalar kullanılarak analiz edilmektedir. Histogramlar sonra hücre boyutu, PI fluo görüntülemek için oluşturulanrescence yoğunluğu ve GFP floresan. Bu parametreler daha sonra, belirli bir hücre popülasyonu evine eşiklenir olabilir.
Bir yan yana karşılaştırma Tali Görüntü Tabanlı Sitometre ve geleneksel akış sitometri, iki yöntem hücre canlılığı ve protein ekspresyonu ilişkin karşılaştırılabilir veriler sağlamaktadır olduğunu göstermektedir. Ancak, Tali enstrüman, bir akış sitometre kullanılarak elde edilemeyen hücre popülasyonu hakkında ek görsel bilgi sağlar.
Protocol
Discussion
Biz sadece, canlılığı sayımları yerine ve Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP ifade değerlendirmek için bir prosedür ayrıntılı var. Aynı prosedürü kullanarak, bu sitometresinin diğer testleri de dahil olmak üzere bir dizi performans yeteneğine sahip olmayan transduced hücreleri kullanarak, apoptoz, RFP ve hücre canlılığı analiz.
Hücre canlılığı, gen ekspresyonu ve apoptosis Florimetrik testleri 7-12 biyomedikal araştırmaların temel yöntemler haline gelmiştir. Geçmişte, ayrı enstrümantasyon, hücreler hakkında nicel ve görsel bilgi almak için kullanılmaktadır. Heterojen bir nüfus içinde hücreleri hakkında kantitatif bilgi akış sitometri kullanımı yoluyla topladı olsa da, görsel ya da nitel bilgiler floresan mikroskobu 1-4 kullanımı yoluyla toplanmıştır. Burada, biz, halk ve tek tek hücre çalışmaları arasında bir köprü bir teknoloji sunuyoruz. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre, kantitatif da kullanarakta ve aynı anda, tek tek hücrelerin veya hücre popülasyonlarının hakkında görsel hücre veri toplanabilir. Tali enstrüman, gen ekspresyonu, apoptozis testlerin değerlendirilmesi, ilaç etkinlik çalışmaları ve hastalığın ilerlemesi değerlendirilmesi de dahil olmak üzere bir dizi uygulamalar için kullanılabilir.
Tali Görüntü Tabanlı Sitometre yakalar ve elde edilecek hücrelerin alt popülasyonlar hakkında bilgi sağlayan, parlak alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntüleri analiz eder. Örneğin, bu testte, Ölü Hücre Kırmızı boya kullanarak GFP ifade hücre popülasyonu içinde canlı hücrelerin ölü hücreleri ayırt etmek mümkün. Bu canlı hücreler, GFP ifade ölçüm doğruluğu ve sonraki işlemlerde kullanışlı hücreleri nüfus tanımlar. Nüfus içindeki ölü hücreler kültürde çevre koşulları (örneğin, trypsinization veya neden normal hücre ölümü ya da hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan gelen ortaya çıkabileceği unutulmamalıdır.seçilen transfeksiyon / transdüksiyon yöntemi ile indüklenen sporcudan).
İşte biz U2OS hücreleri ile Tali sitometresinin kullanımını göstermektedir. Benzer yöntemler, en memeli ve böcek hücreleri kullanılarak yapılabilir. Her bir hücre hattı için, Tali sitometresinin, nicel GFP ifade veriler, standart bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görsel bir inceleme ile mümkün değildir. Bu sonuçlar flow sitometri ile karşılaştırılabilir olmasına rağmen, zamanının bir kısmını tahsil edilir. Sitometresinin ideal 1 x 10 1 – 5 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon, çapı 5 mikron ile 60 mikron arasında doğru sayma hücreleri yeteneğine sahiptir .
Ölü Hücre Kırmızı boyama protokolü, burada açıklanan dahil olmak üzere çoğu standart boyama protokolleri, işaret etmek önemli, canlı ve ölü hücrelerden ayırt propidium iyodür kullanın. St permeabilize hücreleri canlılığını ölçerken bir meydan okuma sunuyorPI, kuşkulu bir membran ile, herhangi bir hücreyi leke, hücre içi belirteçlerin aining. , Yeşil ya da kırmızı floresan kanalları ile tespit edilebilir herhangi bir floresan boya veya protein Tali Görüntü Tabanlı Sitometre analiz edilebilir, gelecekteki çalışmalar amin reaktif canlılığı boyalar 4 gibi alternatif boyaların kullanımı, keşfedebilirsiniz. 2006 Perfetto ve ark tarafından yapılan bir çalışmada 12, bu boyalar, canlı ve ölü hücre popülasyonlarının ayrımcılık kullanımı kolay ve tekrarlanabilir olduğu bulundu.
Tali gerçekleştirebilirsiniz testlerinin türleri açısından sınırlamalar olduğunu unutmayın. Örneğin, cihaz tarafından kullanılan objektif 4X olduğundan, sayma işlemleri büyük hücre tipleri sınırlıdır: mitokondri veya veziküller gibi alt hücresel yapılar, bakteri hücrelerinin sayısal olamaz. Ayrıca Tali tespit kanalları heyecanlandırmak ve kanalları içinde yayacaktır fluorophores sınırlı olduğunu unutmayın. Iken YFP ve parlak mCherry sinyalleri cbir tespit, dimmer mCherry sinyalleri olamaz. Son olarak, Tali sadece süspansiyon hücreleri analiz. Bu doğru bir slayt yapışan hücreler sayılmaz. Ayrıca, bazı maya ve birincil hücreler de dahil olmak üzere, düzensiz şekilli hücre sayımı için sadece sınırlı bir yeteneği vardır.
Buna ek olarak, gelecekteki çalışmalarda, büyük olasılıkla intrasellüler belirteçlerin ifade değerlendirmek bu sistemin kullanımı ele alınacaktır. Bireysel boyalar Invitrogen Kullanıcı online SpectraViewer aracı (kullanarak komşu kanalları ile spektral örtüşme için kontrol edilebilir www.invitrogen.com / spectraviewer ). Bu teknolojinin yeniliği göz önüne alındığında, tam kapsamlı uygulamalar henüz keşfedilmeyi.
Özetle, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre gösterdi, tek tek hücrelerin değerlendirilmesi yanı sıra cel sağlayan hücre popülasyonlarının eşzamanlı görselleştirme ve analizi için olanak sağlayan yeni bir teknoloji sunuyorl nüfusu basit bir iş akışı ile kompakt bir biçimde.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell’Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
