Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Lebensfähigkeit der Zellen-und Fluoreszenz-Expressions-Assays mit der Tali Image-Based Cytometer durchzuführen.
Abstract
Single-Zelle und der Bevölkerung Informationen werden in der Regel entweder durch Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie erhalten. Allerdings bieten diese beiden Methoden unterschiedliche Informationen. Die Durchflusszytometrie ermöglicht quantitative multi-parametrischen Informationen über physikalische Eigenschaften und Färbung oder einen Ausdruck, nicht aber für die Visualisierung zu ermöglichen. Stand-alone-Fluoreszenzmikroskopie bietet visuelle Daten, aber nicht für einfache quantitative Messungen 1 zu ermöglichen.
Image-basierte Zytometrie schließt die Lücke zwischen diesen beiden Methoden, so dass die schnelle Visualisierung und gleichzeitige quantitative Analyse von Tausenden von Zellen in heterogenen Populationen 2. Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung Lebensfähigkeit der Zellen und grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expression Assays mit der Tali Image-Based Cytometer 3. Die Tali Instrument ist ein 3-Kanal-(Hellfeld, grüne Fluoreszenz, rote Fluoreszenz) Benchtop-Assay-Plattform, die Offers mehrere Vorteile gegenüber der Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Die Tali Zytometer ist weniger teuer, nimmt weniger Platz, weniger wartungsintensiv und die Arbeitsabläufe vereinfacht worden, so dass der Betrieb und die Analyse sehr viel einfacher und schneller ist. Die Tali Zytometer ist der Lage, eine Reihe von Federung zell-basierte Assays, einschließlich GFP und rot fluoreszierendes Protein (RFP) Ausdruck, Apoptose 4-6 und die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse mit Propidiumiodid (PI) 7-11.
Hier zeigen wir die Verwendung des Tali Instrument bei der Durchführung einer Lebensfähigkeit der Zellen Assay in Zellen, die GFP. GFP-transduzierten Zellen gefärbt mit der Tali Viability Kit – Dead Cell Red. Die Zellen werden dann in eine Tali Cellular Analysis Slide pipettiert und in das Durchflusszytometer. Hellfeld, rote Fluoreszenz und grüne Fluoreszenz Bilder werden erfasst und analysiert mit Assay-spezifischen Algorithmen. Histogramme werden dann generiert, um Zellgröße, PI fluo-DisplayFluoreszenzintensität und GFP-Fluoreszenz-Intensität. Diese Parameter können dann zu Hause in einem bestimmten Zellpopulation Schwellenwert werden.
Ein Side-by Side-Vergleich der Tali Image-Based Cytometer und traditionelle Durchflusszytometrie zeigt, dass die beiden Methoden vergleichbare Daten über die Lebensfähigkeit der Zellen und Protein-Expression bieten. Allerdings sieht der Tali Instrument zusätzliche visuelle Informationen über die Zellpopulation, die nicht erhalten werden kann mit einem Durchflusszytometer werden.
Protocol
Discussion
Wir haben gerade ein Verfahren zur Durchführung Lebensfähigkeit zählt und Beurteilung GFP-Expression mit der Tali Image-Based Cytometer detailliert. Nach dem gleichen Verfahren, ist dies Zytometer der Lage, eine Reihe weiterer Tests, einschließlich: Apoptose, RFP und die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse unter Verwendung von nicht-transduzierten Zellen.
Fluorometric Assays der Lebensfähigkeit der Zellen, Genexpression und Apoptose sind zu den wichtigsten Methoden in der biomedizinischen Forschung 7-12. In der Vergangenheit getrennte Instrumentierung wurde verwendet, um quantitative und visuelle Informationen über Zellen zu erhalten. Während quantitative Informationen über die Zellen innerhalb einer heterogenen Bevölkerung hat durch den Einsatz der Durchflusszytometrie wurden sammelte, hat Seh-oder qualitative Informationen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Mikroskopie 1-4 zusammengetragen. Hier präsentieren wir eine Technologie, die die Lücke zwischen Bevölkerung und einzelne Zelle Studien Brücken. Mit der Tali Image-Based Cytometer, quantitative data und visuelle Zelle Daten über einzelne Zellen oder Zellpopulationen können gleichzeitig erfasst werden. Die Tali Gerät kann für eine Vielzahl von Anwendungen einschließlich der Beurteilung von Genexpression, Apoptose-Assays, Studium der Wirksamkeit von Medikamenten und Beurteilung des Fortschreitens der Erkrankung verwendet werden.
Die Tali Image-Based Cytometer erfasst und analysiert Hellfeld, rote Fluoreszenz und grünen Fluoreszenz-Bildern, so dass Informationen über Subpopulationen von Zellen zu erhalten. Zum Beispiel in diesem Test konnten wir tote Zellen von lebenden Zellen innerhalb der GFP-exprimierende Zellpopulation mit Dead Cell Red Farbstoff zu unterscheiden. Dies ermöglicht eine Genauigkeit bei der Messung an lebenden Zellen, die GFP, und identifiziert die Population von Zellen, einsetzbar für Downstream-Processing. Es ist wichtig zu beachten, dass die toten Zellen in der Bevölkerung könnten aus verschiedenen Quellen, einschließlich der normalen Zelltod in der Kultur oder der Zelltod durch Umgebungsbedingungen (zB Trypsinierung oder de verursacht wurde,ath hervorgerufen durch die Transfektion / Transduktion gewählten Methode).
Hier zeigen wir die Verwendung des Tali Zytometer mit U2OS Zellen. Ähnliche Verfahren können durchgeführt unter Verwendung der meisten Säuger-und Insektenzellen werden. Für jede Zelllinie produziert die Tali Zytometer quantitative GFP-Expression Daten, die nicht mit einer visuellen Inspektion der Zellen mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop möglich. Obwohl diese Ergebnisse vergleichbar mit der Durchflusszytometrie sind, werden sie in einem Bruchteil der Zeit gesammelt. Das Durchflusszytometer ist in der Lage genau zu zählen Zellen zwischen 5 um bis 60 um im Durchmesser, idealerweise in einer Konzentration von 1 x 5 bis 1 Oktober x 10 7 Zellen / ml.
Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass die meisten Standard-Färbeprotokollen, einschließlich der Dead Cell Red Färbeprotokoll hier beschriebenen Nutzung Propidiumiodid zu lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Dies stellt eine Herausforderung bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit in Zellen, die für st wurden permeabilisiertaining intrazellulärer Marker, da PI wird jede Zelle mit einem kompromittierten Membran Fleck. Da jeder Fluoreszenzfarbstoff oder Protein, das mit dem grünen oder roten Fluoreszenz-Kanäle nachgewiesen werden kann auf der Tali Image-Based Durchflusszytometer analysiert werden kann, zukünftige Studien untersuchen den Einsatz von alternativen Farbstoffen, wie Amin reaktiven Lebensfähigkeit Farbstoffe vier. Eine 2006 durchgeführte Studie von Perfetto et al. 12 fand diese Farbstoffe einfach zu bedienen sein und reproduzierbare in anspruchsvollen lebenden und toten Zell-Populationen.
Beachten Sie, dass die Tali Grenzen hat in Bezug auf die Arten von Tests es leisten kann. Zum Beispiel, weil das Ziel durch das Instrument verwendet wird 4X, sind Zähloperationen größere Zelltypen beschränkt: sub-zellulären Strukturen wie Mitochondrien oder Vesikel und Bakterienzellen nicht quantifiziert werden können. Beachten Sie auch, dass der Nachweis Kanäle in Tali, um Fluorophore, die begeistern und emittieren innerhalb der Kanäle begrenzt sind. Während YFP und helles mCherry Signale cein erkannt werden, können Dimmer mCherry Signale nicht. Schließlich ist die Tali nur Analysen Zellen in Suspension. Es wird nicht genau zählen haftenden Zellen auf einen Objektträger. Darüber hinaus, während es nur eine begrenzte Fähigkeit zum Zählen Zellen, die unregelmäßig geformt sind, darunter auch einige Hefe und Primärzellen bewirkt.
Darüber hinaus werden zukünftige Studien wahrscheinlich auf die Verwendung dieses Systems bei der Beurteilung der Expression von intrazellulären Markern. Individuelle Farben können für spektrale Überlappung mit benachbarten Kanälen, mit Invitrogen Online SpectraViewer Werkzeug (überprüft werden www.invitrogen.com / spectraviewer ). Angesichts der Neuheit dieser Technologie hat die gesamte Palette der Anwendungen noch zu entdecken gilt.
Zusammenfassend zeigten die Tali Image-Based Cytometer hier präsentiert eine neue Technologie, die für die gleichzeitige Visualisierung und Analyse von Zell-Populationen ermöglicht, wodurch Beurteilung einzelner Zellen sowie cell Populationen in einem kompakten Format mit einem einfachen Workflow.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
| U2OS cells |
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