인간 단백질 아틀라스 이내 조직 Microarrays, Immunohistochemistry의 염색법과 디지털 제작

1. 조직 Microarray 생산을위한 조직을 준비하는 방법 (애니메이션 1) 해당 hematoxylin 스테인드 조직 섹션을 포함하여 관련 포르말린 고정 파라핀 임베디드 자료 (조직이나 세포 샘플을)를 선택합니다. 조직 섹션에 관련 영역을 표시한다. 그것은 파라핀 블록에 대응 자른 hematoxylin의 스테인드 섹션을 가지고하는 것이 좋습니다. TMA 생산에 사용되는 템플릿을 디자인합니다. 이러한 전체 TMA 섹션과 sectioning 문제 이상 항체의 범위 등 기술적인 문제로 인한 아티팩트를 피하기 위해 템플릿 내에서 샘플을 무작위. 방향 설정을위한 템플릿에 추가 오리 엔테이션 마커를 추가합니다. 템플릿에 따라 조직을 구성합니다. 2. 수동 조직 Microarray 제작 (촬영을위한 필수) , 조직 코어의 표준 길이를 구하는 탐침 예 : 4.5 mm (그림 2)를 표시하기 위해서입니다. Guidel샘플 센터 사이의 간격에 대한 아이 네스 : 코어 크기가 0.6 mm – 0.8-1.0 mm 코어 크기가 1.0 mm – 1.8-2.0 mm 코어 크기가 1.5 mm – 2.0-3.0 mm 코어 크기가 2.0 mm – 2.5-4.0 mm 그것은 파라핀으로 균열을 피하기 위해 파라핀 블록의 각 측면에 2.5-3.0 mm 여백을두고하는 것이 좋습니다. 사용되는 선택된 펀치를 탑재합니다. 대신에 펀치를 보유 진수 소켓 나사를 풀어으로 시작합니다. 펀치 허브의 홈에 단단히 V-블록 플라스틱에 금속 봉에 대한 배치하면 펀치가 올바르게 배치됩니다. 나사를 고정하고 금속 클립의 가장자리가 수평인지 확인하십시오. 받는 펀치 왼쪽으로 배치해야합니다 (녹색과 빨간색, 유통 업체에 대한 특정이 표시된). 기증자 펀치 약간 큰 직경을 가지고있는, (그림 3) 오른쪽에 위치해야합니다 (녹색과 청색, 유통 업체에 대한 특정에 표시). XY 조정 단자를 사용하여 X-와 Y-축을 따라 펀치를 이동합니다. 바로 조절 손잡이는 X-축을 따라 펀치를 이동하고 왼쪽 조절 노브는 y 축은 함께 펀치를 이동합니다. 조정 단자가 모두에서 디지털 마이크로 미터 판독이 있습니다. 손잡이를 이동할 때 이들은 활성화됩니다. 리셋 → 제로 / ABS 버튼을 누르십시오. 인치와 mm 사이의 변화 → / 밀리미터 버튼을 누르십시오. 9×8 템플릿 1 밀리미터 펀치를 사용할 때 구멍 사이의 공간은 2.0 mm (구멍의 중심 사이에 측정된)이어야합니다. 카세트를 때리는하고 펀치를 파괴, 당신은 블록으로 너무 멀리 아래로 펀치를 강요하지 않도록하기 위해 홀더에 파라핀 않고 카세트를 넣고 카세트의 바닥 위에 1mm로받는 주먹의 바닥 위치를 설정 에 깊이 정지 나사를 사용하여Z-가이드의 왼쪽 위 모서리 (그림 3). 홀더에받는 블록을 넣고 나사를 고정하는 작은 드라이버를 사용합니다. 꽉로 나사를 고정하지 마십시오이나 파라핀은 카세트에서 느슨한 손상시킬 수 있습니다. 받는 블록으로 아래로받는 펀치 약 5mm 밀어하고 (그림 3) 번 앞뒤로 펀치를 회전 펀치에 핸들을 사용합니다. 가능한 한 블럭에까지 아래로 펀치를 밀어 때 구멍이 5mm 깊이 될 것입니다. 온천가 펀치를 이동할 수 있도록 천천히 아래로 밀어 압력을 완화. 펀치를 비우고 파라핀 코어를 삭제하 탐침을 사용하십시오. 기증자 펀치 (그림 3)로 전환하는 터렛으로 이동합니다. 받는 블록 홀더 이상 기증자 블록 (그림 3)과 기증자 블록 다리를 놓습니다. 기증자 punc 밀어기증자 블록의 선택된 영역으로 H. 해당 hematoxylin과 관심의 영역이 샘플되어야하는 조직을 찾습니다 표시되었습니다 eosin 스테인드 슬라이드를 사용합니다. 수동으로 왼손과 위치에 기증자 블록을 잡고 오른손으로 펀치를 밀어. 당신은 탐침에 강요하지 말아야합니다. 깊이 정류장 기증자 블록에 맞는 위치에서 펀치 모션을 차단하지 않으므로 그것은 두 번째 마크 탐침에서 볼 때 밀어 중지하는 것이 중요합니다. 일단 펀치 (그림 3)에 손잡이를 회전합니다. 아직 기증자 블록 다리에 기증자 블록을 누른 상태에서 천천히 아래쪽으로 압력을 릴리스합니다. 기증자의 조직이 선호받는 코어보다 짧은 0.5 mm를 찍었다고합니다. 이 과정은 귀중한 대표 조직의 손실을 피하기 위해,받는 블록 표면에 코어의 조절 정렬을 보장합니다. 다리와 기증자 블록을 제거합니다. 하다기증자 펀치는 (점 4) 이전되었다 구멍에 정렬되었는지 확인합니다. 당신은 기증 펀치와 수신자 블록에 구멍이 정렬되지 않을 경우 설정 나사를 사용하여 펀치의 위치를​​ 조정해야합니다. 그 조언이받는 블록의 구멍의 상단에 도달할 때까지 조심스럽게 아래로 펀치를 밀어. 이 자리를 잡고 있지만, 구멍으로 조직 코어를 비우러 탐침을 사용합니다. 코어 표면은 블록 표면에 정렬에 있어야합니다. 받는 주먹으로 터렛 뒤로 이동합니다. XY 조정 단자가있는 다음 위치로 이동합니다. 배열이 완료될 때까지 위의 점 4c부터 반복합니다. 전체받는 블록이 완료되면받는 블록 홀더의 나사를 느슨하게. 40 분 동안 42 블록 ° C를 굽습니다. 유리 슬라이드를 아래로 향하게 sectioning 면적 블록을 넣어. 테스트 튜브 홀더 (또는 다른 적절한 시공) 및 T의 장소 위에 블록으로 유리 슬라이드를 삽입그는 오븐. 베이킹 후 오븐에서 테스트 튜브 홀더를 제거하고 부드럽게 유리 슬라이드를 쓰다듬어하여 블록의 표면을 평평하게. 10 분 냉각 판에있는 유리 슬라이드에 블록을 삽입합니다. TMA에 걸쳐 대표적인 조직을 높이기 위해 각 50 회 섹션에서 품질 관리가 수행됩니다. 3. 방법 섹션 TMAs (애니메이션 2) 섹션 전송 시스템 (HM 355S, Microm)로 마이크로톰를 사용하여 4 μm의 두께 부분을 잘라 버릴거야. 시스템은 현재의 모든 로터리 microtomes 사용할 수 있습니다. 시스템 통합 환승 다리, 온수 물이 욕조와 제어 유니트와 블레이드 캐리어로 구성되어 있습니다. 블레이드에서 섹션 물 목욕으로 전송 다리를 통해 젖은 전송 표면에​​ 미끄러지듯. 섹션들이 민감한 조직 명소 (유방과 뇌 등 예 : 지질 풍부한 조직)의 용융을 피하기 위해, 버리지 않은 후 즉시 물 목욕으로 연결됩니다. 괞찮아superfrost 유리 슬라이드에 CE가 절을 참조하십시오. 섹션 물 속에 남아있을 수있는 시간은 파라핀의 종류 사용하고 수온 왁스에 따라 달라집니다. ° C와 우리는 37-39의 물 목욕 온도를 권장 ° C. 56-58의 융점을 가지고 HistoLab 제품 AB에서 우리 실험실 사용 파라핀 왁스 하룻밤 동안 실온 (RT)에 건조 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입합니다. 슬라이드는 12~24시간 동안 50 ° C에서 구워있다. 당신 브러쉬 예를 들어 사용하여 수동으로 블레이드의 물을 욕조에 섹션을 수송해야 STS없이 microtom 사용하기. 4. 테스트 및 Immunohistochemistry을위한 적정 절차 (애니메이션 3) 각각의 항체는 조직과 다른 세포 유형의 혼합을 포함하는 특별히 고안된 TMAs를 사용하여 표준화된 테스트 절차를 받게됩니다. 목표는 각 항체에 대한 개인과 최적화된 immunostaining 프로토콜을 평가하는 것입니다. 개미를 기반으로 한 초기 희석,일차 항체의 ibody 주식 농도가 테스트됩니다. 이 테스트 염색법의 결과는 프로토콜의 추가 dilutions 및 최적화를 안내하는 데 사용됩니다. 증류수로 크실렌 및 등급 에탄올의 Deparaffinization 및 수화는 immunostaining 전에 수행됩니다. endogeneous 퍼옥시데이즈를 끄지하기 위해 차단하는 단계는 5 분 95 % 에탄올에 0.3 %에서 H 2 O 2를 수행하고 있습니다. 열 유도 에피토프 불러오기 (HIER)는 125에서 4 분간 열원으로 압력 보일러 (Decloaking 챔버, Biocare 의료)를 사용 ° C., 검색 버퍼 산도 6에서 수행되는 끓는 완료 후 슬라이드 압력 보일러에 남아 있으며 90로 냉각하는 허용하는 ° C. HIER에 대한 총 처리 시간은 약 45 분입니다. 어떤 결정적인 결과가 초기 테스트에서 얻어진하지 않으면 추가적인 테스트가 관찰된 염색법 패턴 5 6를 기반으로 이루어집니다. 파일럿 연구는 고전력 증폭기 높은 처리량 설정 내에서 보여주었습니다그 HIER 산도 6,하지만 같은 proteinase, 전자렌지, 높거나 낮은 산도와 버퍼에 끓는와 사전 인큐베이션 등 다른 검색 방법은 물론 사용할 수있는 가장 유용한 항원 검색. 항체 배양 시간, 항체 dilutions 및 Diaminobenzidine (DAB) 배양 시간을 변경 IHC 조건 등을 변경하여 염색법 패턴이 더 결정적인 결과를 줄 수 있습니다. 5. 염색법 프로그램, Autostainer 480 (써모 피셔 과학) 모든 incubations는 RT에서 수행되며,이 프로토콜은 또한 동일한 시약과 수동 설치로 사용할 수 있습니다. 세탁 버퍼에 린스. 15 분 울트라 V 블록과 보육. 세탁 버퍼에 린스. 30 분 일차 항체와 인큐베이션. 세차 버퍼 (X2)에 린스. 30 분 분류 기다려봐 퍼옥시데이즈 폴리머와 인큐베이션. 세차 버퍼 (X2)에 린스. DAB 용액에서 개발10 분. 세차 버퍼 (X2)에 린스. 5 분 * 동안 Mayers hematoxylin에 Counterstaining. 진보 염색법 방법을 사용하는 경우 (예 : Mayers hematoxylin) 농도는 시간에 따라 어떠한 차별화도 필요하지 않습니다. 재귀 염색법 방법 예 : 해리스 hematoxylin는 구조를 강조하기 위해 조직에서 과잉 염료를 제거하는 차별이 필요합니다. 수돗물에 * 린스. 리튬 탄산 물에 씻어 1 분 * 동안 포화 용액에서 1시 5분을 희석. 오분 *에 대한 수돗물로 씻어. 슬라이드 등급 에탄올의 탈수 있으며, 슬라이드는 (PERTEX, Histolab) coverslipped있다 모든 시약은 슬라이드 300 μl의 볼륨에 적용됩니다. * 단계 10-14은 histostaining 악기 (Autostainer XL, Leica)에서 수행하고 coverslipping가 추가로 coverslipper 시스템 (자동화된 유리 coverslipper CV5030, Leica)에서 이루어집니다. 6. 스캔하는 방법슬라이드 스캔 슬라이드 방식이 널리 사용되고있는 디지털 스캐너에 따라 달라집니다,이 프로토콜은 자동화된 스캐닝 시스템 Aperio XT (Aperio 기술)을 사용하여 슬라이드를 스캔하는 방법을 정의합니다. 대한 인간 단백질 아틀라스 설정 20x 배율에서는 조직과 세포에 대한 40x이 사용됩니다. 자동 스캔은 조직의 이질과 TMA에 포함된 다른 조직의 개수에 따라 초점 문제가 발생할 수 있습니다. 먼지, 접착제에서 유리 슬라이드를 닦고 coverslip과 섹션 사이의 기포가 생겼는 지 확인하십시오. 기포의 새말 슬라이드의 경우. 랙에 슬라이드를 넣고 디지털 스캐너의 선반을 배치. 20x 배율에 TMA를 스캔하는 시간은 약 6 분 정도 소요됩니다. Aperio의 소프트웨어는 관심있는 영역을 선택하는 데 사용됩니다. 포커스 포인트 선택은 소프트웨어 내에서 자동으로 이루어집니다. 수동으로 스캔 영역과 초점 포인트의 선택도 가능합니다. 이미지 H 후생성된으로 그것은 평가 및 IHC의 염색법의 주석에 사용될 수 있습니다. 이미지는 실험의 결과를 파일로 유지 및 토론을위한 동료에게 배포할 수 있으며 더 이상 데이터를 게시를 위해 사용됩니다. 이미지는 Aperio에서 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어에서 볼 수 있습니다. 7. 어떻게 인간 단백질 아틀라스에서 즐겨찾기 단백질을 검색하려면 로 이동합니다 www.proteinatlas.org. 좋아하는 단백질, Ensembl ID, UniProt의 가입 번호 또는 HGNC 이름 예 : 인슐린의 이름을 입력합니다. 요약 페이지를 입력하고 정상적인 조직과 장기 요약 아래로 스크롤합니다. 개요 췌장의 단백질 표현을 보여줍니다. "더 많은 조직 데이터"를 클릭하십시오. 당신은 모든 조직은 기관별로 분류 포함 볼 수있는 정상 조직이 볼 입력합니다. 동일한 단백질을 향해 감독이 3 항체에 대한 IHC 결과를 보려면 췌장을 클릭합니다. 안부를 보려면이미지를 클릭 췌장의 GH-해상도 이미지입니다. 암 조직, 세포 및 인간 단백질 아틀라스 내에서 추가로 유효성 검사 데이터의 단백질 발현에 관한 추가 정보는 인간 단백질 아틀라스 웹사이트를 검색하여 찾을 수 있습니다. 8. 대표 결과 애니메이션 1. 어떻게 조직 microarray 생산을위한 조직을 준비하는 방법이 있습니다. 애니메이션 하나를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 애니메이션 2. 방법 섹션 TMAs에 있습니다. 애니메이션 2를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 애니메이션 3. immunohistochemistry 기법이 설명되어 있습니다. 애니메이션 3 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 1. 인간 단백질 아틀라스 웁살라 이내 프로세스의 전체 구조. 조직 코어의 표준 길이를 표시 그림 2. 기증자 탐침 4.5 밀리 예. 그림 3. 수동 조직 microarrayer. 그림 4. 생산 TMAs의 다양한 품질의 예. () 직선 정상적으로 행과 열을뿐만 아니라 파라핀의 가장자리 사이에 충분한 공간으로 TMA를 정렬. (B) 코어의 일부로 TMA가 너무 sectioning 때 상당한 어려움을 초래 가장자리로 닫습니다. (C) TMA t 동안 구운되어 그OO은 오래 올바른 서식없이 붕괴된 TMA 결과. 그림 5. Hematoxylin 및 eosin의 스테인드의 TMAs. 직선 및 정렬 열과 행을 가진 () 제대로 잘라 절을 참조하십시오. 잘못되었거나 더러운 칼날을 사용하여 분할 (B) 또는 압축된 부분 (C)이 발생할 수 있습니다. 그림 6. 항체의 적정. () 림프절의 반응 중심 전지는 배경없이 특정 세포질 염색법 (갈색 표시된)에서 발생하는 최적 titrated 항체를 보여줍니다. (B) 조직 부분이 약하 염색법을 보여줍니다. 음성 또는 약한 염색법은 일차 항체의 농도가 대상 단백질이 immunostained 조직에 존재하지 너무 낮은 경우 또는 경우에 발견됩니다. (C) 조직 섹션은 일차 항체의 너무 높은 농도로 사용하기 때문에 overstained있다. D, 이상의 누설 반응과 거짓 양성을 건너 때문에 subcellular 위치를 결정하는 어려움의 방주 컬러 결과입니다.