Productie van Weefsel Microarrays, Immunohistochemie vlekken en Digitalisering Binnen het menselijke eiwit Atlas

1. Hoe weefsels Bereid je voor op Tissue Microarray Productie (Animatie 1) Selecteren van relevante formaline gefixeerd paraffine ingebed materiaal (weefsel of cel monsters), inclusief bijbehorende hematoxyline gekleurd weefsel sectie. Markeer relevant gebied op het weefsel sectie. Het wordt aanbevolen om een ​​vers gesneden hematoxyline gekleurd gedeelte overeenkomt met de paraffineblok hebben. Ontwerp de template voor TMA productie. Randomize de monsters binnen de sjabloon om artefacten als gevolg van technische problemen, zoals de dekking van het antilichaam over de hele TMA sectie en snijden problemen te voorkomen. Voeg extra oriëntatie markers om het sjabloon voor de oriëntatie. Organiseren weefsels volgens de template. 2. Handmatig Tissue Microarray Productie (Essentieel voor het filmen) Om een gestandaardiseerde lengte van het weefsel kernen verkrijgen, het stilet bijvoorbeeld 4,5 mm (figuur 2) te geven. Guidelines voor de afstand tussen monster centra: kern grootte 0,6 mm – 0,8-1,0 mm kern grootte 1,0 mm – 1,8-2,0 mm kern maat 1,5 mm – 2.0-3.0 mm kern grootte 2,0 mm – 2.5-4.0 mm Het verdient aanbeveling 2.5-3.0 mm marge aan weerszijden van het paraffineblok laten voorkomen een van de paraffine. Plaats de geselecteerde ponsen worden gebruikt. Begin met het losdraaien van de zeskante schroeven die de punch op zijn plaats houdt. De stempel is goed als de groef in de pons naaf stevig geplaatst tegen de staaf in de kunststof v-blok. Draai de schroeven en zorg ervoor dat de rand van de metalen clip horizontaal staat. De ontvanger punch (aangegeven in groen en rood, specifiek voor distributeur) moeten worden geplaatst aan de linkerkant. De donorpons (aangeduid in groen en blauw, specifiek voor verdeler), die een iets grotere diameter heeft, worden aangebracht aan de rechterkant (figuur 3). Beweeg het ponsen langs de x-en y-assen XY-verstelknoppen. De juiste instelknop beweegt de ponsen langs de x-as en de linker instelknop beweegt de ponsen langs de y-as. Er is een digitale micrometer uitlezing op beide instelknoppen. Deze worden geactiveerd bij het verplaatsen van de knoppen. Reset → Druk op de ZERO / ABS-knop. Verschuiving tussen inches en mm → druk op de IN / mm te drukken. De ruimte tussen de gaten moet 2,0 mm (gemeten tussen de centra van de gaten) wanneer een 1 mm punch voor een 9×8 template. Om ervoor te zorgen dat je niet de stempel drukt te ver naar beneden in het blok, het raken van de cassette en het vernietigen van de punch, zet een cassette zonder paraffine in de houder en zet de onderste positie van de ontvanger punch tot 1 mm boven de bodem van de cassette met de diepte aanslagschroef op hetlinkerbovenhoek van de Z-gids (figuur 3). Zet de ontvanger blok in de houder en de kleinst schroevendraaier de schroeven bevestigen. Niet draai de schroeven vast te strak of van de paraffine zou kunnen breken los van de cassette. Druk op de recipiëntpons naar beneden ongeveer 5 mm in de ontvanger blok en gebruik de hendel in de punch om de stempel een keer te draaien heen en weer (figuur 3). Het gat wordt 5 mm diep bij het duwen van de pons diep in het blok mogelijk. Langzaam Ontlast de neerwaartse druk te duwen, zodat de vering kan de punch omhoog. Gebruik de stilet om de stempel te legen en de paraffine kern te verwijderen. Verplaats de toren over te schakelen naar de donorpons (figuur 3). Plaats de donor blok brug met de donor blok over de ontvanger blok houder (figuur 3). Duw de donor deah in het geselecteerde gebied van de donor blok. Gebruik overeenkomstige hematoxyline en eosine gekleurde dia waarin het gebied van belang is voorzien om het weefsel dat is bemonsterd vinden. Handmatig Houd de donor blok op zijn plaats met uw linkerhand en duw de stempel met uw rechterhand. Merk op dat je niet moet druk op de stilet. De diepteaanslag niet blokkeert de punch beweging op de juiste positie voor de donor blok, dus het is belangrijk dat u stopt met het duwen als het tweede merk zichtbaar is op de stilet. Draai de hendel op de stempel een keer (figuur 3). Langzaam laat de neerwaartse druk, terwijl nog steeds de donor blok op de donor blok brug. De donor weefsel wordt bij voorkeur geperforeerd 0,5 mm korter dan de ontvanger kern. Dit proces zal zorgen voor een verstelbare uitlijning van de kernen op de ontvanger blok oppervlak, het vermijden van verlies van waardevolle vertegenwoordiger van weefsel. Verwijder de brug en de donor blok. Makenervoor dat de donorpons is uitgelijnd met het gat dat eerder werd gedaan (punt 4). U moet pas de punch met behulp van de stelschroeven indien de donor punch en het gat in de ontvanger blok niet zijn uitgelijnd. Voorzichtig naar beneden drukken de stempel totdat de punt bereikt de top van het gat in de ontvanger blok. Houd deze positie, gebruikt u de stilet om het weefsel kern leeg in het gat. De kern oppervlak moet in lijn met het blok oppervlak. Verplaats de toren terug naar de ontvanger punch. Ga naar de volgende positie met de XY aanpassing knoppen. Herhaal vanaf punt 4c hierboven totdat de array is voltooid. Wanneer de gehele ontvanger blok klaar is, draai de schroeven in de ontvanger blok houder. Bak het blok 42 ° C gedurende 40 minuten. Leg het blok met het snijden naar beneden gericht op een glasplaatje. Plaats de glazen dia met het blok op de top van een reageerbuis houder (of een andere passende constructie) en de plaats in tHij oven. Na het bakken, verwijder de reageerbuis houder uit de oven en plat het oppervlak van het blok door zachtjes strelen het glaasje. Leg het blok met de glazen dia op een koelplaat gedurende 10 minuten. Om representatief weefsel in de TMA zorgen voor een kwaliteitscontrole op elke 50 e deel wordt uitgevoerd. 3. Hoe te TMA's (Animatie 2) Snijd 4 micrometer dikke panelen met behulp van een microtoom met sectie Transfer System (HM 355S, Microm). Het systeem kan gebruikt worden met alle huidige rotatiemicrotomen. Het systeem bestaat uit een bladdrager met geïntegreerde overdracht brug, een verwarmd waterbad en een besturingseenheid. Van het mes de secties glijden op de natte overdracht oppervlak via een overgang brug in het waterbad. De delen moeten worden genomen uit het waterbad direct na uitgestrekt, om het smelten van gevoelig weefsel plekken (bijv. vetrijke weefsels, zoals borst-en de hersenen) te vermijden. Place de sectie op een SuperFrost glasplaatje. De tijd dat de secties kunnen achterblijven in het water afhankelijk van het type van paraffine harsen gebruikt en de temperatuur. Het gebruik lab paraffine uit HistoLab Products AB, die een smeltpunt van 56-58 ° C en wordt aanbevolen een waterbad temperatuur van 37-39 ° C. hebben Plaats de objectglaasjes in een houder voor het drogen van de kamertemperatuur (RT) over 's nachts. De glaasjes gebakken 50 ° C gedurende 12-24 uur. Met behulp van een microtom zonder STS je moet het gedeelte van het mes naar een waterbad handmatig transporteren met behulp van bijvoorbeeld een borstel. 4. Test-en Titratie Procedure voor immunohistochemie (Animatie 3) Elk antilichaam wordt onderworpen aan een gestandaardiseerde testprocedure gebruikt speciaal TMA met een mix van weefsels en verschillende celtypen. Het doel is om een ​​individuele en geoptimaliseerde immunokleuring protocol te beoordelen voor elk antilichaam. Aanvankelijk een verdunning op antiBODY voorraad concentratie van het primaire antilichaam is getest. De uitkomst van deze test kleuring wordt gebruikt voor de verdere verdunningen en optimalisatie van het protocol te begeleiden. Deparaffinization en hydratatie in xyleen en graduele ethanol gedistilleerd water te worden uitgevoerd voorafgaand aan immunokleuring. Een blokkerende stap endogene peroxidase demping wordt uitgevoerd in 0,3% H 2 O 2 in 95% ethanol gedurende 5 minuten. Warmte Induced epitoop (hier) wordt uitgevoerd in een geautomatiseerd buffer pH 6, een druk ketel (onthulling kamer Biocare Medical) als warmtebron gedurende 4 minuten bij 125 ° C. Na volledige koken dia blijven de druk ketel en afgekoeld tot 90 ° C. De totale doorlooptijd van HIER is ongeveer 45 minuten. Indien geen afdoende resultaat wordt verkregen in de eerste proef, zijn verdere tests uitgevoerd op basis van waargenomen kleuringspatroon 5 6. Een pilot-studie, binnen het HPA high-throughput set-up, toondede meest bruikbare antigenen waarin HIER pH 6, maar andere methoden voor het ophalen als pre-incuberen met proteinase, magnetron met een kooktraject buffer met hogere of lagere pH kan uiteraard worden gebruikt. Door het veranderen van de IHC staat bijvoorbeeld bij het veranderen antilichaam incubatietijden, antilichaam verdunningen en diaminobenzidine (DAB) incubatietijden de kleuringspatroon kan meer overtuigende resultaten. 5. Kleuring Program, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Alle incubaties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en dit protocol kan worden gebruikt als een handmatige installatie met dezelfde reagentia. Spoel ze in wasbuffer. Incubatie met Ultra V blok voor 5 minuten. Spoel ze in wasbuffer. Incubatie met het primaire antilichaam gedurende 30 minuten. Spoel ze in wasbuffer (x2). Incubatie met mierikswortelperoxidase gemerkt-polymeer gedurende 30 minuten. Spoel ze in wasbuffer (x2). Het ontwikkelen van in DAB oplossinggedurende 10 minuten. Spoel ze in wasbuffer (x2). Tegenkleuring in Mayers hematoxyline gedurende 5 minuten *. Bij gebruik van een progressieve kleuringsmethode (bijv. Mayers hematoxyline) de intensiteit is afhankelijk van tijd en geen differentiatie nodig is. Een regressieve kleuringsmethode bijvoorbeeld Harris hematoxyline vereist differentiatie om overtollige kleurstof te verwijderen uit de weefsels om te accentueren een structuur. Spoel in leidingwater *. Spoel in lithium carbonaat water, verdund 1:05 van de verzadigde oplossing gedurende 1 minuut *. Spoel in leidingwater gedurende 5 minuten *. De slides zijn gedehydrateerd in graduele ethanol en dia's worden afgedekt (PERTEX, Histolab) Alle reagentia worden toegepast met een volume van 300 ul per preparaat. * Stappen 10-14 worden gedaan in een histostaining instrument (Autostainer XL, Leica) en afdekken wordt bovendien gedaan in een Coverslipper systeem (Automated glas Coverslipper CV5030, Leica). 6. Scanneneen Slide De scanmethode dia is afhankelijk van de digitale scanner wordt gebruikt, definieert dit slechts het scannen een dia de geautomatiseerde aftastsysteem Aperio XT (Aperio Technologies). In het menselijk eiwit Atlas opstelling 20x voor het weefsel en 40x de cellen gebruikt worden. Automatische scan kunnen ondervinden focusproblemen door heterogeniteit van het weefsel en het aantal verschillende weefsels in een TMA. Reinig het glasplaatje tegen vuil, lijm en controleer dan op luchtbelletjes tussen het dekglaasje en de sectie. In het geval van luchtbellen remount de dia. Plaats de slede in een rek en plaats het rek in de digitale scanner. De tijd om een ​​TMA te scannen bij een vergroting van 20x is ongeveer 6 minuten. Een software van Aperio wordt gebruikt voor het gebied van belang te kiezen. Focus punt selectie wordt automatisch gemaakt in de software. Handmatig selectie van de scan en de aandachtspunten is ook mogelijk. Nadat het beeld hzoals gegenereerd kan worden gebruikt voor de evaluatie en annotatie van de IHC kleuring. Beelden blijven als gevolg bestand van het experiment en kunnen worden gedistribueerd naar collega's voor discussies en verder gebruikt voor het publiceren van de gegevens. De beelden kunnen worden bekeken in een vrij beschikbare software van Aperio. 7. Hoe kan ik zoeken naar je favoriete eiwit in het menselijk Protein Atlas Ga naar www.proteinatlas.org. Voer de naam van uw favoriete eiwit, Ensembl id, UniProt toetreding nummer of HGNC naam, bv insuline. Voer de overzichtspagina en scroll naar beneden naar de normale weefsels en organen samenvatting. Het overzicht toont eiwitexpressie in alvleesklier. Klik op "meer weefsel gegevens". U komt binnen in de normale weefsels te bekijken waar u kunt zien alle weefsels inbegrepen gesorteerd op orgel. Klik op de alvleesklier om de IHC resultaten te zien voor de 3-antilichamen gericht op hetzelfde eiwit. Om een ​​hi te bekijkenGH-resolutie afbeelding van de alvleesklier Klik op de afbeelding. Aanvullende informatie over eiwitexpressie in kankerweefsel, cellen en verdere validatie van gegevens binnen het menselijke eiwit Atlas is te vinden door te bladeren door het menselijke eiwit Atlas website. 8. Representatieve resultaten Animatie 1. Hoe weefsels voor te bereiden op tissue microarray productie. Klik hier om Animatie 1 te bekijken . Animatie 2. Hoe te TMA's. Klik hier om Animatie 2 te bekijken . Animatie 3. De immunohistochemie techniek wordt beschreven. Klik hier om Animatie 3 te bekijken . Figuur 1. Algemeen schema van het proces binnen het menselijke eiwit Atlas Uppsala. Figuur 2. Donor stilet gemarkeerd voor gestandaardiseerde lengte van weefsel kernen, bijvoorbeeld 4,5 mm. Figuur 3. Manual weefsel microarrayer. Figuur 4. Voorbeelden van verschillende kwaliteit van de geproduceerde TMA's. (A) een rechte uitgelijnd TMA voldoende ruimte tussen de rijen en kolommen en de rand van de paraffine. (B) Een TMA met een aantal van de kernen te dicht bij de rand wat resulteert in mogelijke problemen bij het snijden. (C) A TMA die zijn gebakken too lang wat resulteert in een ingestorte TMA zonder de juiste sjabloon. Figuur 5. Hematoxyline en eosine gekleurde TMA's. (A) Een goed gesneden sectie met recht en uitgelijnd kolommen en rijen. Een slechte of vuil mes kunnen leiden tot splitsing (B) of gecomprimeerd secties (C). Figuur 6. Titratie van antilichamen. (A) Reactie centrum cellen lymfeknoop toont een optimaal getitreerd antilichaam resulteert in een specifiek cytoplasmatisch kleuring (in bruin) zonder achtergrond. (B) Het weefsel sectie toont zwakke kleuring. Negatieve of zwakke kleuring wordt gevonden als de concentratie van primaire antilichaam te laag of het doeleiwit niet in de immunostained weefsels. (C) weefselsectie wordt overstained door gebruik van een te hoge concentratie van primaire antilichaam. De dark kleur resulteert in moeilijkheden het bepalen van de subcellulaire locatie vanwege de spill over, reactiviteit en valse positiviteit over te steken.