La production de puces de tissus, de coloration immunohistochimique et Numérisation Dans l'Atlas des protéines humaines

1. Comment préparer les tissus pour la production de puces à ADN de tissus (Animation 1) Sélectionnez du matériel pertinent pour le formol de paraffine fixe intégré (échantillons de tissus ou de cellules), y compris la section hématoxyline tissu correspondant teinté. Marquez domaine pertinent sur la coupe de tissu. Il est recommandé d'avoir une section teinté fraîchement coupé hématoxyline correspondant au bloc de paraffine. Concevoir le modèle utilisé pour la production de TMA. Randomize les échantillons dans le modèle pour éviter les artefacts causés par des problèmes techniques tels que la couverture de l'anticorps sur toute la section TMA et les problèmes de sectionnement. Ajouter des marqueurs d'orientation supplémentaires pour le modèle de l'orientation. Organiser les tissus en fonction du modèle. 2. Manuel de production de puces à ADN de tissus (Essentiel pour le tournage) Pour être en mesure d'obtenir une longueur standardisée des carottes de tissu, marquez le stylet par exemple 4,5 mm (figure 2). Guidelines pour l'espacement entre les centres de l'échantillon: la taille du noyau 0.6 mm – 0,8-1,0 mm de base de taille de 1,0 mm – 1,8 à 2,0 mm la taille du noyau 1,5 mm – 2,0 à 3,0 mm de base de taille 2,0 mm – 2,5-4,0 mm Il est recommandé de laisser des marges 2,5-3,0 mm de chaque côté du bloc de paraffine pour éviter la fissuration de la paraffine. Montez les poinçons sélectionnés pour être utilisés. Commencez par desserrer les vis à six pans creux qui détient le poinçon en place. Le poinçon est correctement positionné lorsque la rainure dans le moyeu de perforation est fermement placé contre la tige métallique dans la matière plastique v-bloc. Serrez les vis et assurez-vous que le bord de la pince en métal est horizontale. Le poinçon destinataire (marquées en vert et rouge, spécifique pour le distributeur) doit être placé à la gauche. Le poinçon donneur (en vert et bleu, spécifique pour le distributeur), qui a un diamètre légèrement plus grand, doit être placé à la droite (figure 3). Déplacez les poinçons sur les axes x et y les axes en utilisant les boutons de réglage XY. Le bouton de réglage de droite déplace les poinçons long de l'axe x et le bouton de réglage gauche déplace le long des poinçons de l'axe y. Il ya une lecture micromètre numérique sur les deux boutons de réglage. Elles sont activées lors du déplacement des boutons. Réinitialiser → appuyez sur la touche ZERO / ABS. Basculer entre les pouces et mm → appuyez sur la touche IN / mm. L'espace entre les trous doivent être de 2,0 mm (mesurée entre les centres des trous) lors de l'utilisation d'un poinçon 1 mm pour une matrice 9×8. Pour vous assurer que vous ne poussez pas le punch trop bas dans le bloc, frapper et de détruire la cassette du punch, mis une cassette sans paraffine dans le support et régler la position inférieure du poinçon destinataire de 1 mm au-dessus du fond de la cassette à l'aide de la vis de butée de profondeur à ladans le coin supérieur gauche de la Z-guide (Figure 3). Mettez le bloc receveur dans le support et utiliser le plus petit tournevis pour fixer les vis. Ne serrez pas les vis pour serré ou la paraffine peut se détacher de la cassette. Poussez le poinçon destinataire à la baisse d'environ 5 mm dans le bloc receveur et utilisez la poignée dans le poinçon pour faire tourner le poinçon avant et en arrière une fois (figure 3). Le trou sera de 5 mm de profondeur lorsque l'on pousse le poinçon aussi loin dans le bloc que possible. Relâcher la pression à la baisse en la poussant lentement, de sorte que les ressorts peuvent se déplacer le poinçon vers le haut. Utilisez le stylet pour vider le poinçon et jeter le noyau de la paraffine. Déplacer la tourelle pour passer pour le donneur (Figure 3) coup de poing. Placer le pont bloc donneur avec le bloc donneur sur le support de sabot de destinataire (figure 3). Poussez la ponction des bailleurs de fondsh dans la zone sélectionnée du bloc donneur. Utilisez un correspondant hématoxyline et l'éosine lame colorée où la région d'intérêt a été marquée pour localiser le tissu qui doit être échantillonné. Manuellement tenir le bloc donneur en position avec votre main gauche et poussez le coup de poing avec votre main droite. Notez que vous ne devriez pas appuyer sur le stylet. La butée de profondeur ne bloque pas le mouvement coup de poing à la bonne position pour le bloc donneur, il est donc important que vous arrêtez de pousser quand la seconde marque est visible sur le stylet. Tournez la poignée sur le poinçon une fois (figure 3). Relâchez doucement la pression à la baisse tout en maintenant le bloc donneur sur le pont bloc donneur. Le tissu du donneur est de préférence perforée 0,5 mm plus courte que le noyau destinataire. Ce processus permettra d'assurer un alignement réglable des cœurs sur la surface du bloc destinataire, en évitant la perte de tissu représentant précieuse. Retirer le pont et le bloc donneur. Faireassurer que le poinçon donneur est aligné avec le trou qui a été faite plus (point 4). Vous devez ajuster la position de perforation à l'aide des vis de réglage si le poinçon des bailleurs de fonds et le trou dans le bloc receveur ne sont pas alignés. Poussez délicatement le poinçon vers le bas jusqu'à son extrémité atteint le sommet du trou dans le bloc receveur. Tout en maintenant cette position, utilisez le stylet pour vider le coeur des tissus dans le trou. La surface de base doit être en alignement avec la surface du bloc. Déplacez le tourelle arrière à l'emporte-pièce destinataire. Déplacement à la position suivante avec les boutons de réglage XY. Répéter de point 4c ci-dessus jusqu'à ce que le tableau est complet. Lorsque le bloc receveur tout est fini, desserrez les vis dans le support de bloc receveur. Cuire le bloc en 42 ° C pendant 40 minutes. Mettez le bloc avec la zone de coupe vers le bas sur une lame de verre. Placer la lame de verre avec le bloc au-dessus d'un porte-tube à essai (ou autre construction appropriée) et le lieu de til four. Après la cuisson, retirez le support de tube à essai du four et aplatir la surface du bloc par caresser doucement la lame de verre. Placez le bloc avec la lame de verre sur une plaque de refroidissement pendant 10 minutes. Pour assurer le tissu représentant tout au long de la TMA d'un contrôle de qualité sur chaque section du 50 e est effectuée. 3. Comment TMA Section (Animation 2) Couper 4 tranches épaisses um en utilisant un microtome avec système de transfert de l'article (HM 355S, Microm). Le système peut être utilisé avec tous les tomes actuelles rotatives. Le système se compose d'un porte-lame avec le pont de transfert intégré, un bain d'eau chauffée et une unité de commande. De la lame les sections glissent sur la surface de transfert par voie humide par l'intermédiaire d'un pont de transfert dans le bain d'eau. Les sections doivent être prises à partir du bain d'eau immédiatement après qu'ils ont tendu, pour éviter la fusion des taches des tissus sensibles (p. ex tissus lipidiques riches comme ceux du sein et du cerveau). PlaCE de la section sur une lame de verre SuperFrost. Le temps des sections peuvent être laissés dans l'eau dépend du type de paraffiné utilisé et la température de l'eau. Le cire de paraffine laboratoire utilisation de produits Histolab AB, qui ont un point de fusion de 56-58 ° C et il est recommandé une température de bain d'eau de 37-39 ° C. Placer les lames dans un support de diapositives pour le séchage à température ambiante (RT) pendant la nuit. Les lames sont cuits à 50 ° C pendant 12-24 heures. L'utilisation d'un Microtom sans STS que vous avez à transporter la section de la lame d'un bain d'eau manuellement en utilisant par exemple une brosse. 4. Test et la méthode de titrage pour l'immunohistochimie (Animation 3) Chaque anticorps est soumis à une procédure d'essai normalisée en utilisant spécialement conçus TMA contenant un mélange de tissus et types cellulaires différents. L'objectif est d'évaluer un protocole immunomarquage individuelle et optimisée pour chaque anticorps. Initialement une dilution, sur la base de fourmisla concentration de stock iBODY de l'anticorps primaire est testé. Le résultat de cette coloration test est utilisé pour guider d'autres dilutions et d'optimisation du protocole. Déparaffinage et l'hydratation dans de l'éthanol et le xylène graduée à l'eau distillée sont effectués avant l 'immunomarquage. Un gradin de blocage pour étancher peroxydase endogène est réalisée dans 0,3% de H 2 O 2 dans de l'éthanol à 95% pendant 5 minutes. La chaleur épitope (HIER) est réalisée dans un tampon pH d'extraction 6, en utilisant une chaudière à pression (chambre de révèler, Biocare médical) comme source de chaleur pendant 4 minutes à 125 ° C. Après rempli d'ébullition, les lames restent dans la chaudière de pression et on laisse refroidir à 90 ° C. Le temps de traitement total pour HIER est d'environ 45 minutes. Si aucun résultat concluant n'a pas obtenu lors du test initial, d'autres tests sont effectués sur la base du schéma de coloration observée 5 6. Une étude pilote, au sein de l'HPA haut débit mis en place, a montréque la récupération d'antigène très utile lorsque HIER pH 6, mais d'autres méthodes de récupération tels que la pré-incubation avec la protéinase, micro-ondes et d'ébullition dans un tampon avec un pH supérieur ou inférieur peuvent bien sûr être utilisé. En changeant la condition, par exemple IHC changer les temps d'incubation d'anticorps, les dilutions d'anticorps et les temps d'incubation diaminobenzidine (DAB) le schéma de coloration peut donner des résultats plus concluants. 5. Programme de coloration, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Toutes les incubations sont réalisées à température ambiante et ce protocole peut également être utilisé en tant que configuration manuelle avec les mêmes réactifs. Rincer dans un tampon de lavage. Incubation avec V bloc Ultra pendant 5 minutes. Rincer dans un tampon de lavage. L'incubation avec l'anticorps primaire pendant 30 minutes. Rincer à l'un tampon de lavage (x2). L'incubation avec la peroxydase de raifort marquée-polymère pendant 30 minutes. Rincer à l'un tampon de lavage (x2). Développer en solution DABpendant 10 minutes. Rincer à l'un tampon de lavage (x2). Coloration de contraste dans Mayers hématoxyline pendant 5 minutes *. Lorsque vous utilisez une méthode de coloration progressive (par exemple Mayers hématoxyline) l'intensité dépend du temps et pas de différenciation est nécessaire. Une coloration par exemple la méthode régressive hématoxyline de Harris nécessite la différenciation d'enlever l'excédent de teinture de tissus afin d'accentuer une structure. Rincer à l'eau du robinet *. Rincer à l'eau du carbonate de lithium, dilué à 1:5 de la solution saturée pendant 1 minute *. Rincer à l'eau du robinet pendant 5 minutes *. Les lames sont déshydratées dans de l'éthanol gradué et les lames sont recouvertes (PERTEX, Histolab) Tous les réactifs sont appliqués à un volume de 300 ul par diapositive. * Les étapes 10-14 sont fait dans un instrument histostaining (Autostainer XL, Leica) et de lamelles de protection est en outre fait dans un système de lamelles (lamelles de verre automatisé CV5030, Leica). 6. Comment numériserune diapositive Procédé de lames de balayage est dépendante de la Scanner numérique étant utilisé, ce protocole définit seulement à numériser une diapositive à l'aide du système de balayage automatique Aperio XT (Aperio Technologies). Dans l'atlas des protéines humaines configuration 20x pour le tissu et 40x pour les cellules sont utilisées. Analyse automatisée pourrait se heurter à des problèmes de focus en raison de l'hétérogénéité du tissu et le nombre de tissus différents inclus dans une TMA. Nettoyez la lame de verre de la saleté, de la colle et vérifiez de bulles d'air entre la lamelle et la section. En cas de bulles d'air remonter la diapositive. Mettre la lame dans un rack et placez la grille dans le scanner numérique. Le temps de balayer une TMA à un grossissement de 20x est d'environ 6 minutes. Un logiciel de Aperio est utilisé pour sélectionner la zone d'intérêt. Sélection du collimateur de mise au point se fait automatiquement dans le logiciel. Manuellement la sélection de la zone de numérisation et des points de discussion est également possible. Après l'image de hcomme on l'a produite, elle peut être utilisée pour l'évaluation et l'annotation de la coloration IHC. Les images restent dans un fichier résultat de l'expérience et peut être distribué à ses collègues pour les discussions et en outre utilisé pour la publication des données. Les images peuvent être visualisées dans un logiciel disponible gratuitement sur Aperio. 7. Comment faire pour rechercher votre protéine favorite dans l'Atlas des protéines humaines Parcourir pour www.proteinatlas.org. Entrez le nom de votre protéine favorite, Ensembl id, numéro d'accession ou de l'insuline UniProt HGNC par exemple le nom. Accédez à la page sommaire et défiler vers le bas pour les tissus normaux et le résumé d'organes. La vue d'ensemble montre l'expression de protéines dans le pancréas. Cliquez sur "des données des tissus plus". Vous entrez dans les tissus normaux voir où vous pouvez voir tous les tissus inclus triés par organe. Cliquez sur le pancréas pour afficher les résultats IHC pour 3 anticorps dirigés contre la même protéine. Pour voir un salutgh-résolution d'image de clic sur l'image du pancréas. Des informations supplémentaires sur l'expression des protéines dans les tissus cancéreux, les cellules et les données de validation supplémentaires au sein de l'Atlas des protéines humaines peuvent être trouvées en naviguant sur le site Web de la protéine humaine de l'Atlas. 8. Les résultats représentatifs Animation 1. Comment préparer les tissus pour la production de tissu microarray. Cliquez ici pour voir Animation 1 . Animation 2. Comment TMA section. Cliquez ici pour voir Animation 2 . Animation 3. La technique immunohistochimique est décrite. Cliquez ici pour voir l'animation 3 . Figure 1. Diagramme d'ensemble du processus au sein de la protéine humaine Atlas Uppsala. Stylet donateurs figure 2. Marquée pour la longueur normalisée de carottes de tissu, par exemple 4,5 mm. Figure 3. Microarrayer tissus Manuel. Figure 4. Exemples de qualité différente des TMA produites. (A) une. Droite et bien alignée TMA avec un espace suffisant entre les rangées et les colonnes ainsi que vers le bord de la paraffine (B) Une TMA avec quelques-uns des noyaux trop près du bord entraînant des difficultés de probables lorsque la coupe. (C) Une TMA qui ont été cuits pour too à long entraînant une effondré TMA sans le modèle correct. Figure 5. Hématoxyline et éosine TMA colorées. (A) une section de coupe avec correctement colonnes droites et alignés et de rangées. Utilisation d'une lame mauvaise ou sale peut entraîner de fendage (B) ou des sections comprimées (C). Figure 6. Titrage des anticorps. (A) la réaction des cellules dans les ganglions du centre montre un anticorps de façon optimale titré résultant en une coloration cytoplasmique spécifique (en brun), sans arrière-plan. (B) La coupe de tissu montre une faible coloration. Coloration négative ou faible est constaté lorsque la concentration de l'anticorps primaire est trop faible ou si la protéine cible n'est pas présente dans les tissus immunocolorées. (C) La section des tissus est due à l'utilisation overstained de concentration trop élevée de l'anticorps primaire. Le ddes résultats couleur arche difficultés à déterminer la localisation subcellulaire en raison de déborder, traverser la réactivité et la fausse positivité.