Summary

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Published: February 22, 2012
doi:

Summary

בדו"ח זה אנו מתארים שיטה למחוץ העצב העכבר הנשה. שיטה זו משתמשת מלקחיים עוצר דמום זמינים ובקלות reproducibly מייצרת העצב המלא למחוץ הנשה. בנוסף, אנו מתארים שיטה להכין mounts שרירים שלמים מתאימים לניתוח של התחדשות עצבים אחרי למחוץ גיד הנשה.

Abstract

הדור הבא של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) נלמדת באופן נרחב גם על הרלוונטיות שלה למחלות האדם להבין את התגובה משובי חזקים רכוב על ידי נוירונים PNS ובכך אולי שהאירו את הכישלונות של התחדשות מערכת העצבים המרכזית 1. למעוך גיד הנשה (axonotmesis) הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר של פגיעה עצבית היקפית במכרסמים 2. ריסוק קוטע את כל האקסונים אלא רבדים שוואן התאים הבזליים נשמרים כך התחדשות כי הוא אופטימלי 3,4. זו מאפשרת לחוקר לבחון דווקא את היכולת של האקסון הגוברת לקיים אינטראקציה עם התא הן שוואן ואת רבדים הבסיס 4. החולדות היו בדרך כלל את הדגמים המועדפים על בעלי חיים למחוץ העצב ניסיוני. הם זמינים באופן נרחב ועל גיד הנשה lesioned שלהם מספק קירוב סביר של נגעים עצב אנושיים 5,4. אם כי קטנים יותר מאשר עצב חולדה, עצב העכבר יש תכונות דומות רבות. והכי חשוב אם כי, mousמודלים אלקטרוניים הם בעלי ערך יותר ויותר בגלל הזמינות רחב של קווי מהונדס כעת מאפשרת לנתיחה מפורט של מולקולות בודדות קריטיים עבור התחדשות עצבים 6, 7. חוקרים קודמים השתמשו בשיטות רבות כדי לייצר דלוקה עצב או פציעה כולל מלקחיים זווית פשוטים, מלקחיים, מלקחיים מצוננים עוצר דמום, Clamps כלי הדם, וכן החוקר מלחציים, שנועדו 8,9,10,11,12. החוקרים השתמשו גם שיטות שונות של סימון האתר כולל פגיעה תפר, חלקיקי פחמן חרוזי ניאון 13,14,1. אנו מתארים את השיטה שלנו להשיג דלוקה מלאה reproducibly גיד הנשה עם סימון מדויק ועקבי של האתר, למעוך בעזרת מלקחיים עוצר דמום דקים פחמן לאחר המדליקה האתר סימון. במסגרת תיאור שלנו הליך גיד הנשה למחוץ כללנו גם שיטה פשוטה יחסית של כל שריר לעלות לאחר מכן אנו משתמשים כדי לכמת התחדשות.

Protocol

1. בעלי חיים נושאים 1.1. טיפול הנהלים כל בעלי החיים יש לבצע באישור בעלי חיים טיפול של מכון המקומית ועדת האתיקה ועל פי שימוש ו ועדת המכונים הלאומיים הנחיות בריאות, עם הצעדים שננקטו כדי ?…

Discussion

הצגנו שיטה להשיג דלוקה מלאה ומהימנה גיד הנשה עם סימון מדויק של אתר דלוק. כאמור, למעוך גיד הנשה הוא מודל נפוץ של פגיעה עצבית היקפית בעכברים וחולדות. למרות כל שיטה של ​​התאהבות יש יתרונות וחסרונות, מצאנו שיטה זו הופק דלוקה שלמה סומן בקלות עם מינימום של ציוד מיוחד (מלחצי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH K08NS065157 (כדי TAF) בנוסף, מרכז פן על צ'כית, מספר פרס P30AR050950 מן המכון הלאומי של דלקת פרקים, מחלות השלד והשרירים והעור נתמך בעבודה זו (TAF וסטיבן ס 'שרר). לבסוף, שריינרים ילדים מרכז המחקר זרע מימון (TAF) נתמך על העבודה הזאת. ברצוננו להודות לד"ר יאנג, ג'ין בן עבור בתחילה הוכחת הר ההליך כולו ואיימי א 'קים על עזרתה בהפקת סקיצות של איור 1.

Materials

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Mini Clipper with No. 0000 Blade Roboz RC-5903
Nair Hair Remover (9 oz.) Church and Dwight Co., Inc. N/A
Betadine Surgical Scrub (1 gallon) Fisher Scientific 19066452
Ophthalmic Ointment (1 oz.) Fisher Scientific 19082795

Surgical Tools:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
FST 250 Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Iris Scissors (11 cm long) World Precision Instruments 500216
Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11024-18
McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) World Precision Instruments 14124-G
Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11252-30
Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11251-35
Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) Fine Science Tools 13020-12
Powdered Activated Carbon (500 g) Fisher Scientific C272-500
Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) Roboz SUT-1073-11
Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) World Precision Instruments 500345
9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) World Precision Instruments 500346

Animal Care:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) Hospira 0409-4888-20
Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) Harvard Apparatus 507222F

Surgical Platform and Retractors:

(purchased at local hardware store)

Name (description/) Quantity
Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) 1
Button Magnets (Example: Eclipse E825) 3
Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) 3
Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) 9
Rubber Bands (Light Tension) 3
Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) 3

Semi-Thins:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18431
Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18465
Propylene Oxide (450 mL) Ted Pella, Inc. 18601
Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) Electron Microscopy Sciences 14120
Toluidine Blue (25 g) Ted Pella, Inc. 19451

Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL)

Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. 50-61-00
Triton X-100 (100 mL) Dot Scientific Incorporated 9002-93-1
Glycine, 98% (1 kg) Fisher Scientific AC12007-0010
Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) Fisher Scientific 14-373-65
Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) Fisher Scientific NC9492579
Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) Fine Science Tools 26001-40
Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) Sigma-Aldrich T0195-.5MG
Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) Covance SMI-312R
Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) SV2
Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 Novus Biologicals NB300-143
Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific Jackson ImmunoResearch 115-095-205
DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-495-152
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) Invitrogen D3571
Vectashield Mounting Medium (10 mL) Vector Laboratories H-1000
Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) Fisher Scientific 12-548-5C

References

  1. Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
  2. Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).
  3. Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).
  4. Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28, 458-470 (2008).
  5. Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).
  6. Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse – adaptation of the sciatic static index. J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).
  7. Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. Standardized crush injury of the mouse median nerve. J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).
  8. Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion. Neuroreport. 21, 782-785 (2010).
  9. Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve. Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).
  10. Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse. BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).
  11. Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve. J. Anat. 206, 69-78 (2005).
  12. Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).

Play Video

Cite This Article
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).

View Video