Nanoinjection emparelhado e Eletrofisiologia Ensaio para a tela de bioatividade dos compostos utilizando os Drosophila melanogaster Sistema Fibra Gigante
Summary
Uma rápida<em> In vivo</em> Ensaio para testar compostos neuromoduladores usando o sistema de fibra gigante (GFS) do<em> Drosophila melanogaster</em> É descrito. Nanoinjections na cabeça do animal, juntamente com gravações eletrofisiológicas do GFS pode revelar bioatividade dos compostos nos neurônios ou músculos.
Abstract
Os compostos de rastreio para a actividade in vivo pode ser usada como um primeiro passo para identificar candidatos que podem ser desenvolvidos em 1,2 agentes farmacológicos. Nós desenvolvemos uma nova ensaio nanoinjection / electrofisiologia que permite a detecção de efeitos modulatórios bioactivos de compostos sobre a função de um circuito neuronal que medeia a resposta de fuga em Drosophila melanogaster 3,4. O nosso ensaio in vivo, que utiliza o sistema de fibra de Drosophila gigante (GFS, Figura 1) permite a triagem de diferentes tipos de compostos, tais como pequenas moléculas ou péptidos, e requer apenas quantidades mínimas de eliciar um efeito. Além disso, a Drosophila GFS oferece uma grande variedade de potenciais alvos moleculares nos neurônios ou músculos. As fibras gigantes (FG) sinapse electricamente (Junções Gap), bem como quimicamente (colinérgica) sobre uma sinapse periférica Interneuron (PSI) e do músculo tergo Trochanteral neurónio (TTMn) 5 </sup>. O PSI para DLMn conexão (neurônio muscular longitudinal dorsal) é dependente Dα7 receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) 6. Finalmente, a junção neuromuscular (JNM) do TTMn eo DLMn com o salto (TTM) e os músculos de vôo (DLM) são glutamatérgica 7-12. Aqui, é mostrado como para injectar quantidades nanolitros de um composto, enquanto que a obtenção de electrofisiológicos gravações intracelulares a partir do sistema de fibra gigante 13 e como para monitorizar os efeitos do composto sobre a função deste circuito. Nós mostramos especificidade do ensaio com methyllycaconitine citrato (MLA), um antagonista nAChR, que interrompe o PSI para DLMn ligação, mas não o GF para TTMn ligação ou a função do JNM no salto ou músculos de voo.
Antes de começar este vídeo é fundamental que você observar cuidadosamente e se familiarizar com o vídeo intitulado "JOVE gravações eletrofisiológicas da via fibra gigante de D. melanogaster "de Augustin et al 7, como o vídeo aqui apresentado destina-se como uma expansão a esta técnica existente. Aqui usamos o método gravações eletrofisiológico e foco em detalhes apenas na adição dos nanoinjections emparelhados e técnicas de monitoramento.
Protocol
Discussion
O bioensaio nanoinjection / eletrofisiologia aqui apresentada permite uma rápida triagem de compostos no sistema nervoso da mosca da fruta. Este é um novo na técnica in vivo que requer pequenas quantidades de um composto para eliciar um efeito sobre uma variedade de alvos moleculares em um circuito bem caracterizado neuronal. Este método pode ser usado para testar a bioactividade de compostos diferentes, a partir de toxinas desconhecidos para comercialmente disponíveis agentes farmacológicos. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Mari eo laboratório Godenschwege, em especial Aline Yonezawa, para comentários e ajudar com este protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame R21NS06637 concessão para FM e TAG; AB foi financiado pelo número prêmio National Science Foundation 082925, URM: Biologia Integrativa para futuros pesquisadores.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
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